שחזור וניתוח תלת מימד של מבנים עצביים תת-תאיים דקים באמצעות נתוני מיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת קרן יונים ממוקדת

Summary

צינור מתודולוגי גמיש לזיהוי, הדמיה וכימות של תהליכים עצביים תת-תאיים דקים בתוך נפחי תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים הסורק קרן יונים ממוקדת באמצעות חבילות תוכנה ידידותיות למשתמש בקוד פתוח.

Abstract

ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מאפשרת כעת ניתוח תלת מימדי מהיר (תלת מימד) של תהליכים תת-תאיים אולטרה-דקים. כאן, מוצג צינור מתודולוגי לזיהוי, הדמיה וניתוח של תהליכים עצביים דקים, כגון אלה המוקרנים לתוך הבוטונים הפרה-סינפטיים של נוירונים אחרים (המכונים 'ספינולים'). באמצעות חבילות תוכנה הזמינות בחינם, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בעץ החלטות כדי לזהות מבנים תת-תאיים עצביים נפוצים באמצעות קריטריונים מורפולוגיים בתוך נפחי תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM), עם תשומת לב מיוחדת לזיהוי מגוון של ספינולים המוקרנים לתוך בוטונים פרה-סינפטיים. בפרט, פרוטוקול זה מתאר כיצד לעקוב אחר ספינולים בתוך סינפסות עצביות כדי לייצר שחזורים תלת מימדיים של הקרנות תת-תאיות דקות אלה, נויריטני ההורים שלהם ושותפים פוסט-סינפטיים. בנוסף, הפרוטוקול כולל רשימה של תוכנות קוד פתוח הזמינות בחינם לניתוח נתוני FIB-SEM ומציע טיפים (למשל, החלקה, תאורה) לשיפור שחזורים תלת מימדיים להדמיה ופרסום. פרוטוקול ניתן להתאמה זה מציע נקודת כניסה לניתוח מהיר בקנה מידה ננומטרי של מבנים תת-תאיים בתוך נפחי תמונה FIB-SEM.

Introduction

חקירות של יחסי מבנה-פונקציה של רכיבים תת-תאיים דקים בננומטר נהנות לעתים קרובות מהדמיה וניתוח תלת מימד¹. עם זאת, מחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת חתך טורי הוגבלו זמנית ומרחבית על ידי הצורך להשתמש בסכין יהלום כדי לחתוך וליישר מאות עד אלפי מקטעים אולטרה-דקים טוריים של ≥40 ננומטר. אילוצים אלה הגבילו את היכולת לדגום ולנתח ביעילות מבנים תת-תאיים דקים (בקוטר <40 ננומטר), והצורך להיות מיומן בחתך טורי אולטרה-דק פגע ביישום של ניתוחים מבניים תלת מימדיים ^2,3. עם זאת, ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) חוללה מהפכה במהירות וברזולוציה של נפחי תמונה הניתנים להשגה וכעת מאפשרת ניתוח כמותי של מבנים תת-תאיים דקים כגון רשתית אנדופלזמית חלקה ^4,5, סינפסות עצביות ^3,6 ושלפוחיות סינפטיות ^7,8 בקנה מידה. בנוסף, שימוש נרחב יותר בנפחי תמונה FIB-SEM האיץ את הפיתוח של מאגרי נפח תמונה FIB-SEM נגישים בחינם⁹ ותוכנות ניתוח תלת מימד (למשל, Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴) המרחיבים את טווח ההגעה של טכנולוגיה זו ומאפשרים כעת חקירות של המבנה והתפקוד של מבנים תת-תאיים עדינים.

תכונה תת-תאית ננומטרית כזו היא ה'ספינול' הסינפטי העצבי. ספינולים הם דקים (~0.06-0.15 מיקרומטר רוחב, 0.1-1 מיקרומטר אורך), בליטות דמויות אצבע הנובעות מתא עצב אחד ונעטפות על ידי הנויריט (למשל, בוטון פרה-סינפטי) של נוירון אחר^15,16. ספינולים המשובצים בתהליכים עצביים דווחו בספרות מיקרוסקופ האלקטרונים במשך כמעט 60 שנה¹⁷, ובליטות דמויות ספינול הן תכונה שמורה^{של 18,19,20 ו-21,22} בכל מקום של סינפסות מעוררות. עם זאת, למרות התפשטותם של ספינולים סינפטיים, תפקידיהם נותרים מעורפלים, ויש מחסור בנתונים הדרושים כדי להסביר את שכיחותם ושימורם המבני. היעדר אפיון ניסיוני זה של ספינולים נבע בעיקר מהקושי בניתוח כמותי של שכיחות וגדלים של ספינולים. הממדים הקטנים שלהם מתאימים ביותר לניתוחים באמצעות רזולוציית z (עומק) שלא הייתה ניתנת להשגה בעבר (כלומר, ≤15 ננומטר).

כאן, מוצג צינור ניתוח FIB-SEM לזיהוי, הדמיה וניתוח מבנים תת-תאיים דקים (עם חתכים ברוחב ≤40 ננומטר) שיכולים לשמש כנקודת כניסה למצטרפים חדשים ומומחים של FIB-SEM כאחד. פרוטוקול זה משמש כפריימר לזיהוי מבנים תת-תאיים עצביים בתוך נפח תמונה תלת-ממדי FIB-SEM, תוך שימת דגש כיצד להשתמש בקריטריונים ספציפיים כדי לזהות ולסווג תת-סוגים של ספינולים וסינפסות. בנוסף, הפרוטוקול מדגים כיצד לייבא נפחי תמונה לפלטפורמת תוכנה חינמית לניתוח תלת מימד (Reconstruct), להשתמש בתוכנה זו כדי לעקוב אחר ספינולים בתוך סינפסות עצביות מעוררות, ולייצר שחזורים תלת מימדיים של הקרנות תת-תאיות אלה, עצבי האב שלהם ובוטונים פרה-סינפטיים עוטפים. לבסוף, הפרוטוקול מראה כיצד להשתמש בתוכנת רנינג תלת מימד חינמית בקוד פתוח (בלנדר) כדי להחליק את ה'עור' על שחזורים תלת מימדיים להדמיה ופרסום פוטנציאלי, ומפרט את היתרונות והמלכודות הפוטנציאליות של טכניקה זו.

Protocol

1. נתוני נפח תמונה וגודל אובייקט תת-תאי: שיקולים ורישום

1. השג נפח תמונה FIB-SEM איכותי של אזור העניין המכיל את האובייקטים התת-תאיים המעניינים.
   הערה: פרוטוקול זה משתמש במקטעים של נפח תמונה FIB-SEM מקליפת המוח הראייתית הראשונית של חמוס מתבגר מאוחר (24.2 x 16.2 x 2.4 מיקרומטר, ווקסלים איזוטרופיים של 4 ננומטר), ונפח FIB-SEM נגיש באופן חופשי מההיפוקמפוס CA1 של חולדה בוגרת (10.2 x 7.7 x 5.3 מיקרומטר; ווקסלים איזוטרופיים של 5 ננומטר) הזמינים על ידי מעבדת נוט (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). זה קריטי להכין גושי רקמות עבור FIB-SEM באמצעות פרוטוקול השומר על פרטים אולטרה-מבניים ומייצר ניגודיות גבוהה בתנאי הדמיה FIB-SEM^23,24. חשוב לציין, יש לדמות את הרקמה כך שרזולוציית הווקסל של תמונת FIB-SEM המתקבלת היא <0.5 × גודל הקוטר של המבנה התת-תאי הקטן ביותר המעניין. לדוגמה, מכיוון שהאתרים של בליטת עמוד השדרה לתוך בוטונים פרה-סינפטיים יכולים להיות קטנים עד 30 ננומטר בקוטר, גודל ווקסל של <15 ננומטר יהיה מתאים לדגימת מבנים אלה מעל קריטריון נייקוויסט. בנוסף, שימושי לצלם רקמות ברזולוציה איזוטרופית (שווה בכל הממדים) (למשל, ווקסלים של 5 x 5 x 5 ננומטר) כדי לאפשר הדמיה ושחזור של מבנים עדינים בעלי ממדים שווים בכל מישורי x/y/z.
2. הורד והתקן את הפצת פיג'י של ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
3. יישר את נפח התמונה.
   הערה: בעוד שמערכות FIB-SEM מודרניות מייצרות נפחי תמונה מיושרים באופן גס, רישום תמונה לתמונה עדיין עלול לסבול מסחיפה תת-פיקסלית.
   1. בפיג'י, נווט אל תוספים | הירשם ובחר Register Virtual Stack Slices. עיין במדריך למשתמש לקבלת סיוע (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). התחל עם רישום קשיח ולאחר מכן השתמש בטכניקת אפין במידת הצורך.
4. שנה את נפח התמונה.
   1. פתח את נפח התמונה המיושר בפיג'י על ידי לחיצה על קובץ | יבוא | רצף תמונות וניווט לתיקייה עם התמונות המיושרות.
   2. בחלון הדו-שיח, לחץ על מיין שמות מספרית אם התמונות נקראות בסדר מספרי. לחץ על השתמש במחסנית וירטואלית לביצועי פיג'י מהירים יותר.
   3. לאחר פתיחת התמונה, לחץ על תמונה | מאפיינים , ומוסיפים את הגודל הפיסי של נפח התמונה פיקסלים במיקרומטר בתיבות גובה, רוחב ועומק פיקסלים. הקלד um או μm בכל אחת מהתיבות השמאליות ביותר. שמור נפח תמונה מיושר זה כקובץ .tiff על-ידי לחיצה על קובץ | שמירה בשם | טיף.
      הערה: אם קנה המידה של התמונה השתנה, החלק העליון של התמונה אמור לציין כעת את גודל התמונה במיקרומטר (למשל, 9.82 x 8.65 מיקרומטר).

2. זיהוי נויריט וספינול סינפטי

1. תוך כדי גלילה בערימה (באמצעות מקשי החצים או גלגל העכבר), התייחסו לעץ ההחלטות לזיהוי נויריטים (איור 1) ולדוגמאות של נויריטים חתוכים (איור 2) כדי לאתר ולזהות את האובייקטים המעניינים.
   1. זהה ספינולים סינפטיים כבליטות הקשורות לממברנה מנויריט שנעטף במלואו בתוך נויריט פרה-סינפטי או פוסט-סינפטי.
      הערה: זיהוי ספינול סינפטי חיובי דורש ראיות חזותיות של קרום האובייקט המקרין ספינול פולש לתוך הממברנה ההפוכה של מבנה פרה-סינפטי או פוסט-סינפטי ונוכחות של הספינול הקשור לממברנה עטוף במלואו על ידי הממברנה של המבנה הקדם-סינפטי או הפוסט-סינפטי בתמונה אחת לפחות.
2. ביצוע אזורי עניין (ROI) בפיג'י
   1. לחץ על כלי מתאים בסרגל הכלים של פיג'י (למשל, כלי סגלגל) ולאחר מכן לחץ וגרור על התמונה כדי ליצור החזר ROI. רשום החזר ROI זה במנהל ההחזר על ההשקעה על ידי הקלדת האות "T".
      הערה: מנהל ההחזר על ההשקעה אמור להופיע כעת עם קואורדינטות התמונה כשם ברירת המחדל שלו.
   2. שנה את שם ההחזר על ההשקעה כרצונך על ידי לחיצה על כפתור שינוי שם במנהל ה-ROI והקלדת השם הרצוי בתיבת הטקסט שמופיעה. שנה את שמות החזר ההשקעה על סמך קריטריונים כמותיים (למשל, הבוטון הפרה-סינפטי^ה-12 שמנותח ויש לו שתי סינפסות עם קוצים פוסט-סינפטיים עשוי להיקרא B12_s,s).
      הערה: כדי לשייך כל החזר ROI ל"פרוסה" אחת של תמונה (במקום שתהיה נוכחת בכל ערימת התמונות) וכדי להפוך את שמות ההחזר על ההשקעה לגלויים בתמונות בודדות, לחץ על אפשרויות אלה במנהל החזר ההשקעה | קרא עוד | אפשרויות ולאחר מכן לחץ על תיבות הסימון הצג הכל ותוויות בחלק התחתון של מנהל ההחזר על ההשקעה. שים לב ששלב זה הוא קריטי בעת שמירת החזר ROI בנפח תמונה מכיוון ששיוך החזר ROI לכל נפח התמונה ולא לתמונות בודדות יכול להוביל לספירה כפולה של אובייקטים בתוך הנפח.
   3. כדי לשמור את כל ההחזר על ההשקעה כרגע במנהל ההחזר על ההשקעה כקובץ, ראשית, לחץ על כפתור בטל בחירה במנהל החזר ההשקעה, לחץ על כפתור עוד וגלול מטה אל שמור.
      הערה: כעת ניתן לפתוח את קובץ .zip השמור הזה בפיג'י כדי לטעון מחדש את כל ההחזר על ההשקעה במנהל ההחזר על ההשקעה.

3. קבע את תחום העניין והעבר את נפח התמונה לתוכנת ניתוח תלת מימד

1. קבע אם רצוי להעביר את כל נפח התמונה לתוכנת השחזור והניתוח התלת-ממדיים, או אם יש ליצור תת-מחסנית קטנה יותר (ראה 3.3.2) כדי לנתח מספר קטן יותר של תמונות ו/או אזור עניין מהמחסנית המקורית.
2. הפעל מחקר 'פיילוט' קטן על שטח קטן יחסית המכיל את האובייקט/ים המעניינים כדי להעריך את גודל האפקט ומספר האובייקטים המעניינים הנדרשים כדי להשיג את הכוח הרצוי להשוואות סטטיסטיות. השתמש בהערכה שמרנית של גודל נפח התמונה הנדרש לדגימת האובייקטים המעניינים אם אובייקטים תת-תאיים אלה מפוזרים באופן לא אחיד בנפח התמונה.
3. כדי להשתמש בחלק מנפח התמונה לניתוח תלת מימד, שכפל תחילה את נפח התמונה על ידי לחיצה על תמונה | שכפל.
   1. כדי להשתמש בחלק שנחתך מהתמונה לניתוח, בחרו בכלי מלבן מסרגל הכלים של פיג'י וציירו את אזור העניין הרצוי. אם זה לא רצוי, המשך לשלב הבא.
   2. עבור לתמונה | ערימות | כלים | צור Substack. הקלד את טווח התמונות שייכללו בתת-הערימה (לדוגמה, כלול תמונות מ-1 עד 500 על-ידי הקלדת 1 - 500) בתיבת הטקסט.
   3. עיין בשיקולי הדגימה לעיל (הערה לאחר 1.1) כדי לקבוע את רזולוציית z הנדרשת על סמך גודל האובייקט/ים המעניינים. לדוגמה, אם לנפח התמונה יש עומק ווקסל של 5 ננומטר, ניתן לדגום את האובייקט המעניין במרווחים של 10 ננומטר בממד z כך שפיג'י תשמור על כל תמונה אחרת בתת-המחסנית. לשם כך, הקלד את מספר התמונה ה-n אחרי הטווח (למשל, כדי לכלול רק כל תמונה אחרת בטווח תמונות של 1 - 500, הקלד 1 - 500 - 2).
      הערה: לכל חבילת תוכנה לניתוח תלת-ממד (ראה טבלה 1) יהיו דרישות ייבוא קבצים משלה. פרוטוקול זה מתמקד בייבוא נפחי תמונות שנשמרו כקבצי .tiff לתוכנת נפח התמונות, Reconstruct.

4. 3D שחזורים וניתוח של מבנים תת-תאיים דקים בשחזור

הערה: כדאי מאוד להשתמש בעכבר המצויד בגלגל בזמן השימוש בשחזור. בנוסף, אם רוב העקבות או כולן יבוצעו באופן ידני, שימוש בעט אלקטרוני כדי לצייר קווי מתאר במחשב עם מסך מגע יכול להגדיל באופן דרמטי את יעילות המעקב.

1. הורד והתקן את Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) לשימוש במחשב שבו פועל Microsoft Windows בסביבה מקורית או וירטואלית.
2. התחל שחזור חדש על ידי יצירת תיקיה חדשה לקבצי השחזור, לחיצה על סדרה | חדש, ושמירת שחזור זה (קובץ .ser) עם שם הקובץ הרצוי בתיקיה שנוצרה זה עתה.
3. ייבא את נפח התמונה שנשמר .tiff ל-Reconstruct.
   1. נווט לסדרה | יבוא | תמונות, לחץ על בחר בחלון ייבוא תמונות ואתר את קובץ נפח התמונה. בחלון ״ייבוא תמונות ״, חפש/י את קובצי אמצעי האחסון של התמונות שמופיעים כקו נפרד עבור כל תמונה באמצעי האחסון.
   2. חשוב: הקלד את גודל הפיקסלים הנכון בתיבת הטקסט גודל פיקסל כך שיתאים לגודל הפיקסלים x/y (במיקרומטר) של נפח התמונה. לאחר שזה נעשה, לחץ על כפתור הייבוא בחלון ייבוא תמונות .
      הערה: לאחר ייבוא התמונות, אמורה להופיע תמונה באמצע החלון Reconstruct , והרשימה Import Images צריכה להיות ריקה.
   3. אם יש תמונה באמצע החלון Reconstruct והרשימה Import Images ריקה, לחץ על Quit בחלון Import Images.
   4. הגדר את עובי הקטע (כלומר, גובה הווקסל או ממד z) על ידי לחיצה על סעיף | רשימת קטעים, הדגשת כל הקטעים המפורטים, ולאחר מכן לחיצה על שינוי | עובי בתפריט רשימת מקטעים והקלדת עובי המקטע (במיקרומטר) בתיבת הטקסט (למשל, 0.005 למקטע בעובי 5 ננומטר).
      הערה: זכור שאם עובדים עם תת-מחסנית מנפח תמונה מקורי גדול יותר הכולל רק כל קטע n (ראה שלב 3.3.3), יש צורך לקחת בחשבון את החלקים ה'חסרים' הללו בעובי הקטע הכולל. לדוגמה, אם עובי קטע נפח התמונה המקורי (המכונה גובה ווקסל) היה 0.005 מיקרומטר, ותת-הערימה כוללת רק כל קטע שלישי (למשל, 1-500-3), עובי הקטע של תת-מחסנית זו הוא 0.015 מיקרומטר (כלומר, 0.005 מיקרומטר x 3 חלקים).
4. צור עקבות של האובייקטים המעניינים.
   1. עברו לסדרה | אפשרויות | הכרטיסיה Names/Colors כדי לתת שם לאובייקט החדש. בחר צבע לקווי המתאר ולמילוי הפנימי של עקבות האובייקט ולחץ על OK.
      הערה: שחזור ינסה לחבר את כל המעקבים עם אותו שם כמו אובייקט אחד. עיין במדריך השחזור למוסכמות שמות מעקב (למשל, אל תכלול רווחים בשמות). צבעי עקבות נועדו אך ורק להמחשת עקבות; ניתן לשנות בקלות את הצבע של השחזור התלת-ממדי של אובייקט זה מאוחר יותר.
   2. בסרגל הכלים, בחר את הכלי ציור ביד חופשית שנראה כמו עיפרון. החזק את לחצן העכבר השמאלי לחוץ וגרור את העכבר כדי לעקוב אחר הממברנה של האובייקט; שחרר את לחצן העכבר השמאלי כדי להשלים את המעקב באופן אוטומטי. לחץ על Page Up / Page Down או השתמש בגלגל העכבר כדי להתקדם למקטע האופטי הבא בנפח התמונה ובצע עקבות בהדרגה עד להשלמת המבנה.
5. מעקב אחר ספינולים סינפטיים
   הערה: ספינולים משובצים בתוך בוטונים פרה-סינפטיים מופיעים כמבנים שקופים הקשורים לממברנה, לעיתים עם חומר אטום אלקטרונים דמוי אקטין ו/או קפלים דמויי ממברנה בחלק הפנימי שלהם.
   1. התקדמו דרך נפח התמונה ואתרו את אתר התפשטות הספינול לתוך הבוטון הפרה-סינפטי, תוך הקפדה להבדיל בין ספינולים לרטיקולות אנדופלזמיות, ואקולים, אנדוזומים, אוטופאגוזומים ואברונים תת-תאיים אחרים.
      הערה: בניגוד לאברונים הקשורים לממברנה, ודא שספינולים סינפטיים תמיד מקרינים (כלומר, ממברנה החוצה) נויריט/גליה ומתקבלים על ידי (כלומר, קרום הפוך) מבנה קדם-סינפטי או פוסט-סינפטי. עדות חזותית זו לפלישת ספינול צריכה להתרחש בתמונות ≥2, וספינול הקשור לממברנה עטוף במלואו צריך להיות נוכח בתוך המבנה הקדם-סינפטי או הפוסט-סינפטי בתמונה ≥1. ספינולים קטנים עשויים להיות מצופים קלתרין. כדי להבדיל בין אירועי התפשטות של ספינול מאנדוציטוזיס מצופה קלתרין לתוך נויריט קדם-סינפטי או פוסט-סינפטי, ודא שזיהוי חיובי של ספינולים מצופים קלתרין דורש אישור חזותי של הממברנה היוצאת במקביל מאובייקט האב של הספינול המקרין לתוך הממברנה ההפוכה של מבנה קדם-סינפטי או פוסט-סינפטי באותה תמונה.
   2. התקדם דרך נפח התמונה כדי לאתר את אתר ההקרנה/מקור של הספינול מהנויריט/גליה האב שלו; עיין באיור 1 ובאיור 2 כדי לסייע בזיהוי מבני אב אלה.
   3. התחל את עקבות הספינול באתר בליטת הממברנה לתוך המבנה המקבל (למשל, בוטון פרה-סינפטי) והמשך לצייר את הספינול כל עוד הוא מופיע כמבנה הקשור לממברנה בתוך הנויריט הקדם-סינפטי או הפוסט-סינפטי.
   4. המשך להחזיק את לחצן העכבר השמאלי לחוץ (או המשך לצייר לאורך קרום הסיבוב עם חרט אלקטרוני אם אתה משתמש במחשב עם מסך מגע) תוך כדי מעקב אחר קרום הספינול עם מצביע העכבר.
   5. כאשר תגיע לנקודה שבה התחיל המעקב, שחרר את לחצן העכבר השמאלי.
      הערה: שחרור כפתור העכבר השמאלי מוקדם מדי ישלים אוטומטית את המעקב, לעתים קרובות עם תוצאות לא רצויות. אם זה קורה, פשוט לחץ על מחק כאשר מעקב זה מסומן ברשימת המעקב.
   6. חזור על שלבים 4.5.2-4.5.5 עבור כל מקטע שבו מופיע העמוד.
      הערה: זכור לעקוב אחר הספינול כמבנה הקשור לממברנה בתוך הבוטון במידת הצורך. מכיוון ששחזור אינו מאפשר חיסור אוטומטי של מבנים תת-תאיים עטופים (למשל, ספינולים, אברונים תת-תאיים) מנפח המבנה העוטף, ניתן לבצע זאת לאחר מכן (למשל, פשוט על ידי הפחתת נפח הספינול מהנפח הכולל של הבוטון הפרה-סינפטי).
6. בנייה מחדש של אובייקטים בתלת-ממד ב-Reconstruct
   1. נווט לסדרה | אפשרויות | 3D וודא שלחצן האפשרויות Traces נלחץ.
   2. פתח את רשימת האובייקטים על-ידי לחיצה על אובייקטים | רשימת אובייקטים.
   3. לאחר ששמות האובייקטים שעקבתם נטענים בחלון, לחץ פעמיים על שם האובייקט/ים ברשימת האובייקטים כדי להציג אותם בתלת-ממד. המתינו להופעת החלון 'סצנה תלת-ממדית '.
   4. ודא שההתחלה, הסיום והספירות של המעקבים נכונים ברשימת האובייקטים עבור כל אובייקט, כך שהספירה = סוף - התחלה. אם ה- Count ≠ End - Start עבור אובייקט, ייתכן שעקבה אחת או יותר מאובייקט זה הושמטה בטעות.
   5. סובב את העקבות התלת-ממדיות של האובייקטים על-ידי לחיצה ממושכת על לחצן העכבר השמאלי והזזת העכבר ו/או לחיצה ממושכת על לחצן העכבר הימני והזזת העכבר קדימה ואחורה כדי להגדיל ולהקטין את התצוגה. ודא שהעקבות של האובייקט מיושרות כראוי ונראה שיש מעבר חלק בין כל עקבה עוקבת.
   6. במידת הצורך, שחזר עקבות בודדות כדי להסיר שגיאות המובילות לקצוות חדים ו/או מעברים בין עקבות.
   7. הניחו עור רשת טטרהדרלי על האובייקט על ידי ניווט אל סדרה | חפץ | לשונית תלת מימד ולחיצה על כפתור הבחירה משטח Boissonnat .
   8. בחלון סצנה תלת מימדית , לחץ על סצנה | נקה ולאחר מכן לחץ פעמיים על שם האובייקט הרצוי ברשימת האובייקטים.
   9. סובב את האובייקטים כדי להבטיח מעברים חלקים בין עקבות וצייר מחדש עקבות במידת הצורך.
   10. כדי לשנות את צבעי האובייקט ואת השקיפות יש ללחוץ על שם האובייקט ברשימת האובייקטים ולאחר מכן ללחוץ על סצנה | צבע/שקיפות... בתפריט רשימת אובייקטים . לחץ פעמיים על שם האובייקט ברשימת האובייקטים כדי להציג שינוי זה בחלון סצנה תלת-ממדית .
       הערה: ניתן לשנות את צבע, שקיפות והחלקה של אובייקט עם מידה רבה יותר של שליטה וספציפיות באמצעות בלנדר (ראה 5.4-5.6).
7. ניתוח כמותי של אובייקטים תלת מימדיים
   1. נווט לסדרה | אפשרויות | הכרטיסייה רשימות ולחץ על כל המידות הרצויות במקטעים רשימת אובייקטים ורשימת מעקב בחלון זה.
   2. ייצוא מידות האובייקטים על-ידי פתיחת רשימת האובייקטים (אובייקט | רשימת אובייקטים...) ולאחר מכן לחיצה על רשימה | שמור.
   3. שמור את מידות האובייקטים כפי שהן מוצגות ברשימת האובייקטים כקובץ מופרד באמצעות פסיקים (.csv).
   4. ייבא את קובץ .csv לתוכנת ניתוח הנתונים לבחירתך. כדי לייבא לגיליון אלקטרוני (למשל, Microsoft Excel), פשוט לחץ פעמיים על הקובץ, או פתח חוברת עבודה ריקה חדשה, לחץ על קובץ | יבוא | CSV ובצע את ההוראות.
   5. כדי למדוד את המרחקים בין אובייקטים בתלת מימד (למשל, כדי למדוד את מרחק ההקרנה של ספינול סינפטי בתוך בוטון פרה-סינפטי), השתמש בפונקציית Z-trace ב-Reconstruct.
   6. ראשית, תן לעקבה שם חדש על ידי ניווט אל הסדרה | אפשרויות | הכרטיסיה Names/Colors והקלדת שם עבור המעקב Z.
   7. לאחר מכן, לחץ על הכלי Z-trace בסרגל הכלים.
   8. כדי לצייר את עקבות ה-Z של מרחק ההקרנה של ספינול סינפטי, לחץ על תחילת הסיבוב הסינפטי על ידי לחיצה על כפתור העכבר השמאלי, ולאחר מכן לחץ על הלחצנים Page Up או Page Down כדי להתקדם בנפח התמונה תוך לחיצה על נקודות עוקבות לאורך הממברנה של הסיבוב הסינפטי בתוך כל קטע.
   9. השלם את מעקב ה-Z הזה על ידי לחיצה על כפתור העכבר הימני.
   10. ייצא מדידות Z-trace על ידי לחיצה על Trace | עקבות רשימה... כדי להעלות את רשימת המעקב ולאחר מכן לחיצה על רשימה | שמור כדי לשמור את מדידות רשימת המעקב כקובץ .csv.
8. הוספת קוביית קנה מידה
   1. ניווט לאחת התמונות הראשונות או האחרונות בערימה
   2. עברו לסדרה | אפשרויות | הכרטיסיה Names/Colors והקלד שם עבור קוביית קנה המידה.
   3. בסרגל הכלים, בחר בכלי צייר מלבן וצייר ריבוע קטן (גודל לא חשוב) הצמוד לאובייקטים אך לא מסתיר אותם. עברו לסדרה | אפשרויות | 3D, לחץ על אפשרות לחצן האפשרויות Box באזור Create, וציין את גודל קוביית קנה המידה (במיקרומטר) על ידי הקלדת הממדים שלה בתיבות A:, B:, C: באזור Size (למשל, הקלד 0.5 עבור A, B ו-C ליצירת קובייה בקנה מידה של 0.5 מיקרומטר/צד).
      הערה: לפני שתנסה לשחזר את קוביית קנה המידה בתלת-ממד, ודא שהאובייקטים התלת-ממדיים הרצויים כבר שוחזרו בסצנה התלת-ממדית באמצעות האפשרות Traces או Boissonnat surface . זכור לשנות את האפשרות צור בחזרה למשטח Boissonnat ואת הגדלים של A, B ו-C בחזרה ל-1 לאחר שחזור קוביית קנה המידה (כלומר, לאחר שלב 4.8.5).
   4. פתח את רשימת האובייקטים ולחץ פעמיים על שם קוביית קנה המידה; המתינו עד שקוביית קנה המידה תופיע בחלון הסצנה התלת-ממדית .
   5. כדי להזיז את קוביית קנה המידה ביחס לאובייקטים האחרים, עבור אל סדרה | אפשרויות | לשונית תלת מימד והקלד את מספר המיקרומטר הרצוי כדי להזיז את קוביית קנה המידה לתיבות X, Y ו/או Z . לחץ על אישור כדי לסגור את החלון ולאחר מכן לחץ פעמיים על שם קוביית קנה המידה ברשימת האובייקטים.
      הערה: לחלופין, ניתן לעשות זאת באמצעות בלנדר (ראה להלן).

5. ייבוא, צביעה מחדש, החלקה והוספת שקיפות לשחזורי תלת מימד בבלנדר

הערה: לסיוע מפורט בשימוש בבלנדר, אנא עיין במדריך הבלנדר ו/או בשלל סרטוני "כיצד לעשות" על השימוש בכל פונקציה של בלנדר (פשוט בצע חיפוש באינטרנט עבור בלנדר והפונקציה הרצויה). להלן פריימר קצר כיצד לצבוע מחדש, להחליק ולהוסיף שקיפות לשחזורים תלת מימדיים.

1. הורד והתקן את הגרסה העדכנית ביותר של בלנדר, חבילת התוכנה התלת-ממדית החינמית בקוד פתוח (www.blender.org).
2. ב-Reconstruct, שמור את השחזורים התלת-ממדיים על-ידי הצגת האובייקטים הרצויים בחלון הסצנה התלת-ממדית ולחיצה על Scene | ייצוא בשם | VRML 2.0.
3. בבלנדר, נווט אל קובץ | יבוא | תלת מימד ניתן להרחבה X3D (.x3d/.wrl). לחץ על קובץ VRML 2.0 שנשמר מ-Reconstruct ולאחר מכן לחץ על כפתור Import X3D/VRML2.
4. צבעו מחדש את השחזורים.
   1. בחלון אוסף סצנות , בפינה הימנית העליונה, לחץ כדי לבטל את הבחירה/ביטול הסימון של סמל העין עבור אובייקט הקובייה המוגדר כברירת מחדל, ולחץ על שמות האובייקטים הבודדים כדי להדגיש כל אובייקט בסצנה. שנה את שמות האובייקטים בהתאם לצורך.
   2. לחץ על שם האובייקט הראשון לצביעה מחדש בחלון אוסף סצנות .
   3. לחץ על ההקשר המעגלי. סמל חומר בחלק התחתון של רצועת הסמלים הימנית ולאחר מכן לחץ על הוסף חומר. רשימת אפשרויות אמורה להופיע למטה. לאחר מכן, לחץ על הסרגל שליד צבע בסיס אפשרות ובחר את הבהירות והגוון הרצויים עבור האובייקט.
   4. לשינוי המראה המתכתי, הברק והאיכויות המשקפות של העצם, התאימו את האפשרויות 'מטאלי', 'ספקולרי', 'חספוס' ו'ברק ' כדי ליצור את האפקט הרצוי.
      הערה: כדי שאפשרויות מסוימות יופיעו בסצנה (לדוגמה, שקיפות, ברק), ייתכן שיהיה צורך להופיע בהגדרה Viewport Shading: Look Dev או Viewport Shading: Rendered viewport. כדי לעבור לאחת מהגדרות אשנב התצוגה, רחף מעל סמלי הגלובוס בפינה השמאלית העליונה ולחץ על הגדרת אזור התצוגה הרצויה.
   5. כדי לשנות את זווית התאורה, לחץ על אובייקט האור בחלון אוסף הסצנות , לחץ על הצג סמל Gizmo בפינה השמאלית העליונה, ולאחר מכן גרור את האור סביב הסצנה כדי להשיג את אפקט התאורה הרצוי. שנו את עוצמת האור בחלון 'נתוני עצם ' שמופיע מתחת לחלון 'אוסף סצנות' כשבוחרים בעצם האור .
   6. כדי לסובב אובייקטים בצירים נבחרים בנפרד, לחץ על שמות האובייקטים בחלון אוסף סצנות , לחץ על מקש R ולאחר מכן לחץ על האות של ציר הסיבוב (מקש x, y או z ), והזז את העכבר כדי לייצר את הסיבוב הרצוי. כדי לתפוס ולהזיז אובייקטים, בחר אותם בחלון אוסף סצנות , לחץ על מקש G ולאחר מכן השתמש בעכבר כדי להזיז אובייקטים ברחבי הסצנה.
5. לחבר מחדש (כלומר, להחליק) את השחזורים.
   1. לחץ על שם האובייקט המעניין מחלון אוסף הסצנות ולאחר מכן השתמש בגימבל ובגלגל העכבר כדי למרכז ולהגדיל את האובייקט.
   2. לחץ על סמל מפתח הברגים Context.Modifiers ברצועת הסמלים השמאלית, לחץ על הוסף צירוף ולאחר מכן על Remesh (תחת הכותרת צור). השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור חלק, לחץ על הצללה חלקה כפתור ושנה את עומק וקנה מידה של אוקטרי כדי להשיג את החלקות הרצויה.
      הערה: כדאי להיות ב-Viewport Shading: חלון מסגרת תיל (אפשרות סמל גלובוס בפינה השמאלית העליונה) תוך כדי שינוי כדי להציג את התוצאות ישירות. הרשת תיצור רשתות טטרהדרליות בגדלים שונים על האובייקט. בשעת החלקת האובייקט להסרת פריטי חתך או עקיבה, הקפד לשמור על צורתו וקווי המתאר המקוריים שלו. התחל בעומק אוקטרי = 7 וסולם = 0.95, ולאחר מכן הקטן את המספרים הללו לאט במידת הצורך. שימו לב במיוחד לעצמים קטנים ודקים, כמו למשל ספינולים וצפיפות פוסט-סינפטית, שכן הנפח הקטן של העצמים האלה מקטין את טווח ההחלקה שניתן לעשות מבלי לשנות את צורתם המקורית.
6. הוסף שקיפות לאובייקטים.
   הערה: הפיכת אובייקטים לשקופים חשובה כאשר רצוי להראות את הקשר התלת-ממדי של אובייקט אחד (למשל, ספינולים, שלפוחיות פרה-סינפטיות, מיטוכונדריה, אנדוזומים) השוכנים בתוך אובייקט אחר (למשל, בוטון פרה-סינפטי).
   1. לחץ על שם האובייקט הרצוי בחלון אוסף סצנות. גלול לתחתית ההקשר. חלון חומר (סמל ימני תחתון ברשימה הימנית), פתח את הגדרות קטע והשתמש בתפריט הנפתח כדי לשנות את מצב המיזוג ל-Alpha Blend. לאחר מכן, פתח את המקטע משטח, גלול למעלה לאלפא ושנה את המספר לערך קטן מאחד (1 = אטום לחלוטין, 0 = שקוף לחלוטין).
7. ייצא תצלומי בזק של השחזורים התלת-ממדיים.
   1. לאחר שהושגו הצביעה, ההחלקה והתאורה האופטימליים לשחזורי התלת מימד, שמור את התמונה בתוך הסצנה על ידי לחיצה על כותרת התפריט חלון ובחירה באפשרות שמור צילום מסך.
   2. ב שמור צילום מסך אפשרויות בפינה השמאלית התחתונה, בחר את סוג הקובץ, פורמט הצבע והדחיסה הרצויים.
   3. הקלד את השם עבור צילום המסך החדש בתיבת הטקסט שם הקובץ לעיל ולאחר מכן שמור את צילום המסך במיקום הרצוי.

Results

כימות אחוז הספינולים הסינפטיים בתוך אוכלוסיית הבוטונים הפרה-סינפטיים המעוררים בקליפת המוח הראייתית הראשונית של חמוס
למרות שבליטות דמויות ספינול מנוריטים לבוטונים פרה-סינפטיים מעוררים נצפו במשך עשרות שנים^19,26, חשיבותם הפוטנציאלית לתפקוד הסינפטי נותרה מעורפלת. ניסויים אלה נועדו לקבוע את שיעור הבוטונים הפרה-סינפטיים המעוררים המכילים ספינולים לאורך ההתפתחות שלאחר הלידה בקליפת המוח הראייתית הראשונית של החמוס (V1) כדי לוודא את החשיבות הפוטנציאלית ש...

Discussion

צינור ניתוח נפח תמונה FIB-SEM זה יכול לייצר שחזורים תלת מימדיים אמינים ומדידות כמותיות של מבנים תת-תאיים דקים. בעוד שטכניקות אוטומטיות למחצה הנוכחיות המשתמשות ברשת עצבית עמוקה ואלגוריתמי סגמנטציה יכולות להגביר את המהירות והיעילות בשחזור מבנים תאיים בעלי ניגודיות ממברנה גבוהה יחסית בנפחי תמונה גדולים³³, מבנים תת-תאיים רבים (למשל, ספינולים, רשתית אנדופלזמית חלקה, אנדוזומים) יישארו קשים ללכידה מהימנה בשיטות אוטומטיות בשל ניגודיות הממברנה הנמוכה ו/או הפיתול שלהם, אם ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
פיג'י (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
שחזור			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
בסיס		בלנדר בלנדר	https:/www.blender.org