Method Article

יישום של ניתוח זרימה ציטומטרית למדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים באורגנואידים תלת מימדיים במוח

DOI:

10.3791/65621

⸱

August 4th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 4Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 5Department of Neurology, Haukeland University Hospital, 6National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדווח על שיטה ייחודית של שימוש בציטומטר זורם ונוגדנים מרובים להערכה בו-זמנית של פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאלים מרובים, כולל שינויים בנפח המיטוכונדריה, כמויות של תת-יחידות מורכבות של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) ושכפול DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא תורם ראשוני או משני שכיח לסוגים רבים של ניוון עצבי, ושינויים במסה המיטוכונדריאלית, קומפלקסים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) ומספר עותק ה-DNA המיטוכונדריאלי (mtDNA) מופיעים לעתים קרובות בתהליכים אלה. אורגנואידים של מוח אנושי שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) מסכמים את הסידור הציטו-ארכיטקטוני התלת-ממדי של המוח ומציעים אפשרות לחקור מנגנוני מחלה ולסנן טיפולים חדשים במערכת אנושית מורכבת. כאן, אנו מדווחים על גישה ייחודית המבוססת על ציטומטריית זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים באורגנואידים קליפת המוח שמקורם ב-iPSC. דוח זה מפרט פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במוח בקליפת המוח מ-iPSCs, דיסוציאציה של תא בודד של אורגנואידים שנוצרו, קיבוע, צביעה וניתוח זרימה ציטומטרי לאחר מכן כדי להעריך פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-היחידה של קומפלקס MRC NADH: Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B10 (NDUFB10) או גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM) יחד עם ערוץ אניונים סלקטיבי תלוי מתח 1 (VDAC 1) מאפשר הערכה של כמות החלבונים הללו למיטוכונדריון. מכיוון שכמות ה-TFAM תואמת את כמות ה-mtDNA, היא מספקת הערכה עקיפה של מספר עותקי ה-mtDNA לכל תוכן מיטוכונדריאלי. ניתן להשלים את כל ההליך הזה תוך 2-3 שעות. באופן מכריע, הוא מאפשר כימות בו-זמני של פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים, כולל רמות כוללות וספציפיות ביחס למסה המיטוכונדריאלית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הם אברונים תאיים חיוניים והאתר העיקרי של ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP). מעבר לאספקת אנרגיה לתאים, המיטוכונדריה גם משתתפת בתהליכים תאיים מרובים, כולל העברת מידע תאי, התמיינות תאים ואפופטוזיס, ויש לה את היכולת לווסת את צמיחת התאים ואת מחזור התאים. זוהו שינויים בתפקוד המיטוכונדריה במחלות ניווניות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD)1,2, מחלת אלצהיימר (AD)3 וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)4. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ממלא תפקיד בתהליך ההזדקנות, מצטבר מוטציות mtDNA סומטיות וירידה בתפקוד שרשרת הנשימה5.

סוגים שונים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מתרחשים בניוון עצבי, והיכולת למדוד שינויים כאלה שימושית ביותר בעת חקר מנגנוני מחלה ובדיקת טיפולים פוטנציאליים. יתר על כן, הקמת מערכות מתאימות למודל מבחנה המסכמות מחלות בתאי מוח אנושיים חיונית להבנה טובה יותר של מנגנוני המחלה ולפיתוח טיפולים חדשים. iPSCs מחולים עם מחלות נוירודגנרטיביות שימשו ליצירת תאי מוח מגוונים המבטאים נזק מיטוכונדריאלי 6,7,8,9. הפיתוח של אורגנואידים תלת-ממדיים במוח שמקורם ב-iPSCs הוא צעד מרכזי במודלים של מחלות. אורגנואידים מוחיים אלה שמקורם ב-iPSC מספקים מורכבות ומכילים את הרקע הגנטי של המטופל עצמו, ובכך מספקים מודל מחלה המשקף בצורה מדויקת יותר את הפתולוגיה במוחו של המטופל.

אמנם נערכו מחקרים מסוימים במיטוכונדריה על אורגנואידים במוחשמקורם ב-iPSC 10,11,12, אבל הטכניקות הנוחות והאמינות לקביעת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאלים מרובים באורגנואידים במוח שמקורם ב-iPSC עדיין מוגבלות. ציטומטריית זרימה מספקת כלי רב עוצמה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים ברמת התא הבודד, כפי שהדגמנו בעבר13. מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנואידים בקליפת המוח מ-iPSCs, בשילוב עם גישה חדשה מבוססת זרימה ציטומטרית למדידה בו-זמנית של פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים, כולל מסה מיטוכונדריאלית, תת-יחידות מורכבות של שרשרת נשימה ומספר עותק mtDNA (איור 1). חשוב לציין, על ידי שימוש במסה המיטוכונדריאלית כמכנה, פרוטוקולים אלה מאפשרים למדוד הן את הרמות הכוללות והן את הרמות הספציפיות ליחידה מיטוכונדריאלית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. התמיינות של iPSCs לאורגנואידים בקליפת המוח

  1. הכנת צלחות מצופות מטריצה
    1. הפשירו את הבקבוקון של מטריצת קרום הבסיס הזמינה מסחרית על קרח למשך הלילה. יש לדלל ל-1:100 בקור Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/F12 DMEM/F12 של חזיר (ריכוז סופי של 1%). הכינו מינוסים ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים).
    2. מפשירים את תמיסת מטריצת הממברנה ב-4 מעלות צלזיוס (שומרים על קור) ומצפים את מספר הבארות הנדרש (1 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות). יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. קח את הצלחת מהחממה ותן לה להגיע לטמפרטורת החדר (RT) (השאירו אותה למשך שעה).
      הערה: ניתן לאחסן את הצלחות עד שבועיים במקרר (זכרו להוציא אותן ולחמם את הבארות המצופות הנדרשות לאותו יום ב-RT עד שהוא כבר לא קריר למגע לפני השימוש). מומלץ להשתמש בצלחות תוך 3 ימים. לאחסון לאורך זמן, הוסף 1 מ"ל של Essential 8 Medium (ראה טבלת חומרים) לצלחת המצופה כדי למנוע התייבשות של הג'ל.

2. הכנה חיונית 8 (E8) מדיום לתרבית iPSC

  1. בסביבה סטרילית, הכן את E8 Medium על ידי שילוב של E8 בסיסי עם תוסף E8 (ראה טבלת חומרים). ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
    הערה: יש להפשיר תוסף E8 קפוא בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הכנת המדיום המלא. לא מומלץ להפשיר את התוסף הקפוא ב-37 מעלות צלזיוס; יש להשתמש ב-E8 Medium למשך שבועיים. לפני השימוש, נדרש לחמם E8 Medium לאותו יום ב-RT עד שהוא כבר לא קריר למגע.

3. תת-תרבות של iPSCs

  1. מחממים מראש צלחות מצופות מטריצה ב-RT או בחממה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. יש לחמם מראש את כמות ה-E8 Medium הדרושה ב-RT.
  2. שאפו את מדיום התרבות בעזרת פיפטה.
  3. שטפו iPSCs (ראה טבלת חומרים) עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco (Ca2+/Mg2+ חינם) (DPBS-/-) (4 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות).
  4. הוסף חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (0.5 מ"מ) (1 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות). דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס עד ששולי המושבות מתחילים להתנתק מהצלחת (בדרך כלל 3-5 דקות).
  5. שאפו את תמיסת הדיסוציאציה.
  6. הוסף E8 בינוני מחומם מראש (4 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות) והשתמש בלחץ גבוה כדי לנתק מושבות iPSC.
  7. מעבירים לשתי בארות שונות בצלחת מצופה מטריצה של 6 בארות (2 מ"ל לבאר אחת בצלחת של 6 בארות) ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש לנער בעדינות לפני הכנסת הצלחת לחממה. יחס הפיצול יכול להיות 1:2-1:4.
  8. החלף מדיה מדי יום עד שהמושבות מקבלות מפגש של 80% עם גודל וחיבורים טובים.
    הערה: עקוב אחר מושבות בגודל מתאים, המאופיינות בדרך כלל בצורה מעגלית מוגדרת היטב ובקוטר שנע בין 0.5 ל-1 מ"מ. המושבות צריכות להציג מבנים צפופים וקומפקטיים עם גבולות ברורים וחלקים.

4. היווצרות גוף עוברי (EB) ואינדוקציה עצבית

  1. הכן מדיום אינדוקציה עצבית (NIM) על ידי שילוב הרכיבים המפורטים בטבלת החומרים.
  2. שאפו מדיום ושטפו את התאים עם DPBS -/- (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
  3. מוסיפים אקוטאז מחומם מראש (1 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) (ראה טבלת חומרים) בבאר ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 3 עד 4 פעמים באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
  5. לנטרל עם 2 מ"ל DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ולצנטריפוגה את הצינור החרוטי של 15 מ"ל המכיל את התאים ב-600 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את הסופרנטנט.
  6. השעו מחדש את כדורי התא על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה עד למשטחים חד-תאיים.
  7. ספרו וחישבו את ריכוז התאים החיים באמצעות טריפן כחול14 במונה תאים אוטומטי.
  8. חשב את יחס הדילול ודלל תאים ב-NIM כדי ליצור ריכוז תאים סופי של 60,000 תאים חיים/מ"ל.
  9. הוסף את מעכב החלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) Y-27632 (ריכוז סופי 50 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים) לתרחיף התא וערבב בעדינות.
  10. הוסף 150 מיקרוליטר של תרחיף תא בודד לכל באר של צלחת 96 בארות חיבור נמוכה במיוחד (ראה טבלת חומרים) והנח בחממה. הגדר כיום 0.
  11. ביום הראשון, בדוק את התאים ואת צורות ה-EB בכל באר.
    הערה: העריכו היווצרות EB מוצלחת על סמך המראה הבהיר, הכדורי והשקוף שלהם תחת מיקרוסקופ, יכולתם להישאר צפים ונפרדים, והיעדר תאים מתים, המופיעים ככתמים כהים.
  12. ביום השני, הסר 75 מיקרוליטר בינוני מכל באר בזהירות והוסף 150 מיקרוליטר NIM יחד עם 50 מיקרומטר Y-27632 לכל באר.
  13. בימים 4, 6 ו-8, הוציאו 100 מיקרוליטר בינוני מכל באר והוסיפו 150 מיקרוליטר NIM לכל באר.

5. יצירת אורגנואידים בקליפת המוח

  1. הכן מדיום התמיינות עצבית מינוס ויטמין A (NDM-) על ידי שילוב הרכיבים המפורטים בטבלת החומרים.
  2. ביום 10, העבירו EBs מצלחת 96 בארות החיבור הנמוכה במיוחד לצלחת 6 בארות החיבור הנמוכה במיוחד באמצעות פיפטה של 5 מ"ל. העבירו שמונה EBs לכל באר בזהירות (איור 2). הוסף 5 מ"ל NDM- לכל באר.
  3. הנח את הצלחת על שייקר המסלול בתוך החממה והתחל להסתובב ב-80 סל"ד.
  4. בימים 12, 14 ו-16, החלף את ה-NDM- ב-4 מ"ל לאחר שאיבת מדיום ישן של 3 מ"ל.

6. התבגרות ותרבות ארוכת טווח של אורגנואידים בקליפת המוח

  1. הכן מדיום התמיינות עצבית עם ויטמין A (NDM+) וגורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF). לפרטים, ראה טבלת חומרים.
  2. ביום ה-18, הסר את המדיום של 3 מ"ל והוסף 4 מ"ל NDM+.
  3. החזירו את הצלחת לתרבות המסתובבת.
  4. האכילו כל 4 ימים ושמרו על האורגנואידים המובחנים בקליפת המוח ב-NDM+ עד לשימוש. אורגנואידים קליפת המוח בני 25-40 יום שימשו לניתוח במורד הזרם.
    הערה: ניתן לשמור על האורגנואידים בקליפת המוח זמן רב יותר (עד 3-4 חודשים); אבל כדאיות התאים תרד בגלל היעדר חילופי תזונה.

7. אפיון תאים על ידי אימונוציטוכימיה וצביעה אימונופלואורסצנטית

  1. השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לאסוף בעדינות את האורגנואיד מהמדיום ולהניח אותו בעדינות על מדיום עם מדיום מינימלי בשקופית מיקרוסקופ רגילה.
  2. הניחו לו להתייבש לחלוטין ב-RT. הוסיפו 4% פרפורמלדהיד (PFA) (300 מיקרוליטר לדגימה) למשך 30 דקות. יש להסיר את ה-PFA ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS.
    הערה: PFA רעיל וחשוד כמסרטן. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים, ולטפל מתחת למכסה אדים כימי.
  3. מוסיפים 30% תמיסת סוכרוז (300 מיקרוליטר לדגימה) למגלשות ודוגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. חסום וחדור את האורגנואידים עם חיץ חוסם (BB) (300 מיקרוליטר לדגימה) המכיל PBS (עם Ca2+/Mg2+), 0.3% טריטון X-100 ו-10% סרום עיזים רגיל למשך שעתיים ב-RT (או לילה ב-4 מעלות צלזיוס). מתאר את האורגנואידים בעזרת עט מחסום הידרופובי כדי לשמור על המאגר על המגלשה.
  5. שכב דגימות עם נוגדן ראשוני במאגר חוסם (300 מיקרוליטר לדגימה), אנטי-SRY (אזור קובע מין Y)-תיבה 2 (SOX2, 1:100), וסמן אנטי-עצבי טוברין בטא III (Tuj1, 1:1000), ודגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בחושך (ראה טבלת חומרים).
  6. שטפו ב-PBS למשך 3 שעות עם שניים עד שלושה החלפות חיץ על פלטפורמת נדנדה עדינה.
  7. דגירה עם נוגדן משני (300 מיקרוליטר לדגימה), קמח אנטי-אלקסה 488 (1:800) וקמח אנטי-אלקסה 594 (1:800), למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בחדר חושך לח. הוסף כתם גרעיני Hoechst 33342 (1:5000) בו זמנית (ראה טבלת חומרים).
  8. שאפו את הנוגדן ושטפו במהירות עם PBS, ולאחר מכן הוסיפו PBS המכיל 0.01% NaAzide למשך 1-2 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע זיהום.
  9. שאפו את ה- PBS והסירו את התמיסה העודפת. הרכיב את האורגנואידים עם אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן הוסף כיסוי. הימנע מהיווצרות בועות אוויר והנח בחדר חשוך ב-RT למשך 12 שעות לפחות כדי לאפשר להרכבה להתפלמר במלואה.
    הערה: הדגימה מוכנה כעת לדמיון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

8. דיסוציאציה של אורגנואידים בקליפת המוח

  1. הוסף 30 מ"ל DPBS -/- בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  2. אסוף בעדינות את האורגנואידים במוח בצינור באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. לפחות 3 אורגנואידים משמשים לצביעה אחת, והם צריכים להיות בני יותר מ-25 יום אך פחות מ-40 יום.
  3. אורגנואידים משקעים למשך כ -5 דקות. אין צנטריפוגה.
  4. שאפו DPBS והוסיפו 2 מ"ל Accutase מחומם מראש בצינור. דגרו את הדגימה באמבט המים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. יש לשלש 15 פעמים בעדינות באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר מבלי ליצור בועות. דגרו את הדגימה למשך 5 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  6. מנותק בעדינות על ידי שימוש בקצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר 15 פעמים מבלי ליצור בועות (איור 3A).
    הערה: אם עדיין יש כמה תאים לא מפורקים, העבירו את התאים הלא מפורקים לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל ולאחר מכן דגרו למשך 5 דקות נוספות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן התנתק בעדינות על ידי שימוש בקצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר 20 פעמים.
  7. לנטרל עם 4 מ"ל DMEM עם 10% FBS וצנטריפוגה את הצינור החרוטי של 15 מ"ל המכיל את התאים ב-600 x גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  8. שאפו סופרנטנט והשעו מחדש עם 200 מיקרוליטר DPBS באמצעות קצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר 10 פעמים מבלי ליצור בועות.
  9. הוסף 200 μL DPBS כדי ליצור נפח כולל של מתלי תאים של 400 μL ב-DPBS.
  10. סנן עם המסנן או צינור המסנן (השתמש במסננים של 35 או 40 מיקרומטר ושטוף את המסנן עם DPBS לפני השימוש במסנן).
  11. הפרד מחצית מהתמיסה בשפופרת והשתמש בה כדגימה לא מוכתמת.

9. מדידת ציטומטריית זרימה של תת-יחידות מורכבות MRC ו-TFAM בתאים קבועים

  1. הוסף צבע צביעה חי ומת (L/D) (1: 1000) (ראה טבלת חומרים) (עם אדום רחוק או אינפרא אדום קרוב, תלוי בהגדרה של הסמנים לציטומטריית זרימה).
    הערה: אם נפתח בקבוקון חדש לצבע L/D, הוסף 50 מיקרוליטר DMSO כדי להרכיב מחדש וצור מינון של 10 מיקרוליטר כדי לאחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס.
  2. יש לשמור ב-RT ובחושך למשך 30 דקות. הוסף 40 מ"ל DPBS -/-. צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 x גרם למשך 5 דקות.
  3. השעו מחדש לתרחיף חד-תאי לאחר השלכת הסופרנטנט.
  4. תקן וחדור את התאים עם 1 מ"ל 90% מתנול קר כקרח ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. חסום את הדגימות במאגר בלוק של 1 מ"ל המכיל 0.3 M גליצין, 5% סרום עיזים ו-1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS (עם Ca2+/Mg2+).
  6. שטפו עם מאגר זרימה של 20 מ"ל המכיל PBS (עם Ca2+/Mg2+) עם 0.2% BSA פעם או פעמיים.
  7. הוסף את הנוגדנים העיקריים נגד NDUFB10 מצומד עם Alexa Fluor 405 (1:100), אנטי-VDAC 1 מצומד עם Alexa Fluor PE (1:100) ונוגדנים נגד TFAM מצומדים עם Alexa Fluor 488 (1:200) למשך 30 דקות (ראה טבלת חומרים).
  8. שטפו עם מאגר זרימה של 20 מ"ל.
  9. שאפו והשאירו כ-100 מיקרוליטר והרכיבו מחדש את כדורי התא למאגר זרימה של 300 מיקרוליטר.
  10. העבירו את התאים לצינורות זרימה של 1.5 מ"ל. שמור בחושך וקרח.
  11. נתח על ציטומטר הזרימה (ראה טבלת חומרים). אותות זוהו עבור Anti NDUFB10-Alexa 405 באמצעות מסנן פס פס 450/50, TFAM-Alexa 488 באמצעות מסנן פס פס 530/30, VDAC 1-Alexa 647 באמצעות מסנן פס פס 670/14 וצבע L/D במסנן פס פס 780/60 (איור 3B).

10. רכישה וניתוח של ציטומטריית זרימה

  1. השתמש בדגימות לא מוכתמות ומוכתמות בודדות של אורגנואיד הבקרה כדי להגדיר את המתח של הגדרות הציטומטר.
  2. השתמש בשפופרת הבקרה הלא מוכתמת כדי להגדיר את עלילות הפיזור של אזור הפיזור הקדמי (FSC-A) ואזור הפיזור הצדדי (SSC-A) בהתבסס על הגודל והגרעיניות של אוכלוסיית התאים (איור 4A).
  3. הוצא פסולת כדי לבחור תאים חיים מחלקות FSC-A ו-SSC-A. שער החוצה מכפיל באמצעות גובה פיזור צד (SSC-H) לעומת תרשים SSC-A (איור 4B).
  4. בחר את התאים החיים על סמך צביעת צבע L/D על ידי מעבר ל-APC-cy7 לעומת תרשים FSC-A (איור 4C).
  5. באמצעות הדגימות הלא מוכתמות של כל קו, צייר שער מעל האוכלוסייה העיקרית של האירועים ב-FSC-A לעומת עלילות תעלות פלואורוכרום (FITC, APC, BV 421).
  6. ההגדרה מפצה על ציטומטר הזרימה15.
  7. השתמש בבקרת איזוטיפ לבקרה שלילית כדי לצפות בכתמי רקע.
  8. ביצוע איסוף נתונים.
    1. בחר את התאים החיים על סמך צביעת צבע L/D על ידי מעבר ל-APC-cy7 לעומת תרשים FSC-A (איור 4C).
    2. השתמש במה שלא מוכתם כשליטה שלילית. לאחר מכן, תוך כדי בחינת ה-FSC-A לעומת עלילות תעלות פלואורוכרום (FITC, APC, BV 421), מקימות שער מעל האוכלוסייה העיקרית של אירועי תא בודד (איור 4D-F).
  9. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים).
    1. שכפל את מיקומי השערים על דגימות התאים המוכתמים. תעד את מספר התאים המציגים צביעה חיובית.
    2. עבור כל אוכלוסייה ממוקדת, הערך את עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של ערוצים שונים (FITC, APC, BV 421) המשורטטים על ציר ה-x של היסטוגרמה כדי לזהות את האות המיטוכונדריאלי. ניתן לקבוע ערכים ספציפיים עבור תת-היחידה המורכבת I NDUFB10 ו-TFAM על ידי חלוקת ה-MFI של הביטוי המרוכב או TFAM במחוון המסה המיטוכונדריאלי, VDAC 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מספק ייצוג דיאגרמטי של תהליך ההתמיינות והאסטרטגיות המשמשות לניתוח זרימה ציטומטרית. iPSCs אנושיים תורבבו בצלחות של 96 בארות שאינן נצמדות ליצירת EBs ולאחר מכן הועברו לצלחות 6 בארות שאינן דבקות כדי להשיג אורגנואידים קליפת המוח שגדלו במלואם. ההרכב התאי של האורגנואידים אומת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לאחר צביעה חיסונית עם עצב16 וסמני גליה17. אורגנואידים פורקו לתאים בודדים כדי להקל על מדידה מבוססת ציטומטריה של פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במוח בקליפת המוח מ-iPSCs אנושיים ולביצוע ניתוח זרימה ציטומטרי של פרמטרים מיטוכונדריאלים בתאים בודדים שבודדו מהאורגנואידים הללו. ההרכב התאי של האורגנואידים אומת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית עם צביעה אימונוהיסטוכימית לסמני תאי עצב וגליה. הוכח כי האסטרטגיה המבוססת על ציטומטריית זרימה יחד עם אנטי-NDUFB10, VDAC 1 ו-TFAM מאפשרת מדידה של רמות ספציפיות של קומפלקס I ו-mtDNA ביחס למספר המיטוכונדריה בתא. פרוטוקול זה מתאים למדידת מיטוכונדריה בכל סוגי התאים דמויי המוח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מביעים את תודתנו הכנה לגארת' ג'ון סאליבן מהמכון למדעי הרפואה הבסיסיים באוניברסיטת אוסלו, נורבגיה, על שסיפק לנו בנדיבות את קו התאים AG05836 (RRID:CVCL_2B58). אנו מודים באדיבות למרכז ההדמיה המולקולרית, מתקן הליבה של ציטומטריית זרימה באוניברסיטת ברגן בנורבגיה. עבודה זו נתמכה על ידי המימון הבא: K.L נתמכה בחלקה על ידי אוניברסיטת ברגן Meltzers Høyskolefonds (מספר פרויקט: 103517133) ו-Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (מספר פרויקט: 103816102). L.A.B נתמכה על ידי מועצת המחקר הנורווגית (מספר פרויקט: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ו-Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוגדנים המשתמשים בזרימה ציטומטריה
אנטי-DUFB10 Alexa Fluor 405NOVUS biologicalsNBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647טכנולוגיית סנטה קרוזsc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
L / D ניתן לתיקון קרוב IR ערכת כתמי תאים מתיםtechnologiesL10119
נוגדנים המשתמשים בצביעה אימונופלואורנטית
נגד Tuj1Abcamab78078
anti-SOX2 Abcamab97959
קמח אנטי-אלקסה 488תרמו פישר סיינטיפיקA28175
קמח אנטי-אלקסה 594תרמו פישר סיינטיפיקA-21442
<תאים מסחריים>חזקים
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)סופק על ידי גארת' ג'ון סאליבן מהמכון למדעי הרפואה הבסיסיים ב אוניברסיטת אוסלו, נורווגיה
Essential 8 Medium (מדיום תרבית iPSC)
Essential 8 Basal Medium תזונה Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8 (50x) 2% (v/v)Thermo Fisher ScientificA1517101
ב-4 מעלות; C ולחמם ל-RT לפני השימוש.
<חזק>מכשירים
Heracell 150i CO2 אינקובטוריםפישר סיינטיפיק, ארה"ב
שייקרים אורביטליים - SSM1, SSL1סטיוארט ציוד, בריטניה
CCD מיקרוסקופ מצלמה Leica DFC3000G Leica Microsystems, גרמניה
אמבט מים Jb אקדמיה בסיסי Jba5 JBA5 מענק מכשיריםמענק מכשירים, ארה"ב
מערכת שאיבת נוזלים בקרת BVCVacuubrand, גרמניה
Leica TCS SP8 STED מיקרוסקופ קונפוקליLeica Microsystems, גרמניה
50 מ"ל צינור בזSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences, ארה"ב
ניתוח דגימת FlowjoFlowJo LLC, ארה"ב
10 מ"ל פיפטהסיגמא-אולדריץ'SIAL1100
1, 10, 100, 1000 מ"ל פיפטהסיגמא-אולדריץ'
40 ומיקרו; m Cell starinerSigma-AldrichCLS431750
חיבור נמוך במיוחד צלחת 96 בארותS-BIOMS-9096UZ
Countess II מונה תאים אוטומטיThermo Fisher מדיום
<חזק>עצבי  (NDM+)
DMEM/F12Life technologies11330032
Neurobasalmedium Life technologies 2110349
תוסף Glutamax 1% (v/v)Life technologies35050
תוסף N2 0.5% (v/v)Life technologies17502-048
תוסף B27 1% (v/v)Life טכנולוגיות17504-044
&בטא;-מרקפטואתנול 50 ומיקרו; Mסיגמא-אולדריץ'M3148
BDNF 20 ננוגרם/מ"לפפרוטק450-02
חומצה אסקורבית 200 ומיקרו; מסיגמא-אולדריץ' חנות A92902
ב-4° C למשך עד שבועיים
<חזק>מדיום התמיינות עצבית מינוס ויאטמין A (NDM-)
DMEM/F12טכנולוגיות חיים11330032
מדיום נוירובזאליטכנולוגיות חיים2110349
תוסף גלוטמקס 1% (v/v)Life technologies35050
תוסף N2 0.5% (v/ v)טכנולוגיות חיים17502-048
B27 תוספת ללא ויט. 1% (v/v)Life Technologies12587010
&בטא;-מרקפטואתנול 50 ומיקרו; חנות MSigma-aldrichM3148
ב-4° C למשך עד 8 ימים
<חזק>מדיום אינדוקציה עצבית (NIM)
DMEM/F12טכנולוגיות חיים11330032
תחליף סרום נוקאאוט 15% (v/v)טכנולוגיות חיים10828028
תוסף גלוטמקס 1% (v/v)טכנולוגיות חיים35050
β- מרקפטואתנול 100 ומיקרו; MSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 ננומטרStemgent/Reprocell04-0074
SB431542 10 ומיקרו; MTocris1614
XAV939 2 ומיקרו; חנות MSigma-AldrichX3004
ב-4° C למשך עד 10 ימים
<חזק>מדיום נטרול
IMDMטכנולוגיות חיים21980032
FBS 10%סיגמא-אולדריץ'12103C
<חזק>ריאגנטים אחרים
DPBS (ללא Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific14190250
סרום בקר אלבומיןEuropa BioproductsEQBAH62-1000
AccutaseLife טכנולוגיותA11105-01
GeltrexLife טכנולוגיותA1413302
טכנולוגיות EDTALife 15575038
טכנולוגיותDMEM / F12 Life מתקדמות12634010
רקמות עצביות ערכת דיסוציאציהMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632 מעכב סלע דיהידרוכלורידBiotechne Tocris1254
Fluoromount-G™ הרכבה בינוניתSouthernBiotech0100-20
PFAתרמו פישר סיינטיפיק28908
Life תוסף התמיינות מדעי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  3. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  4. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  5. Trifunovic, A., Larsson, N. G. Mitochondrial dysfunction as a cause of ageing. Journal of Internal Medicine. 263 (2), 167-178 (2008).
  6. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  7. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  10. Xu, L., et al. Abnormal mitochondria in Down syndrome iPSC-derived GABAergic interneurons and organoids. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1868 (6), 166388(2022).
  11. Liu, C., et al. Mitochondrial HSF1 triggers mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Huntington's disease. EMBO Molecular Medicine. 14 (7), e15851(2022).
  12. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  13. Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives. The Journal of Visualized Experiments. 177, e63116(2021).
  14. Strober, W. Trypan Blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  15. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. Chapter 1 (Unit 1), 14(2002).
  16. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome Biology. 6 (1), 204(2005).
  17. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  18. Xiang, Y., et al. Generation and fusion of human cortical and medial ganglionic eminence brain organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 47 (1), e61(2018).
  19. Pevny, L., Placzek, M. SOX genes and neural progenitor identity. Current Opinion in Neurobiology. 15 (1), 7-13 (2005).
  20. Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cytoskeleton and Cell Motility. 17 (2), 118-132 (1990).
  21. Rosebrock, D., et al. Enhanced cortical neural stem cell identity through short SMAD and WNT inhibition in human cerebral organoids facilitates emergence of outer radial glial cells. Nature Cell Biology. 24 (6), 981-995 (2022).
  22. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  23. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  24. Yan, Y., Zhang, S. C. Generation of cerebral cortical neurons from human pluripotent stem cells in 3D culture. Methods in Molecular Biology. 2683, 1-11 (2023).
  25. Pamies, D., et al. Human IPSC 3D brain model as a tool to study chemical-induced dopaminergic neuronal toxicity. Neurobiology of Disease. 169, 105719(2022).
  26. Pamies, D., Hartung, T., Hogberg, H. T. Biological and medical applications of a brain-on-a-chip. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J. : Online). 239 (9), 1096-1107 (2014).
  27. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  28. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryBrain OrganoidsMitochondrial ParametersiPSC Derived OrganoidsMitochondrial DysfunctionSingle Cell DissociationMitochondrial MassMRC ComplexesTFAM StainingmtDNA Copy Number
Video Coming Soon

Related Articles