Un protocollo multicolore di visualizzazione ad alta risoluzione 3D-STORM per la mineralizzazione del collagene in fibrille di collagene di tipo I ricombinanti autoassemblate

Summary

Qui presentiamo un protocollo per distinguere la mineralizzazione intrafibrillare da quella extrafibrillare nelle fibrille di collagene ricombinante utilizzando multicolore 3D-STORM, integrando marcatura ottimizzata, imaging e analisi quantitativa di colocalizzazione.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo multicolore tridimensionale di microscopia ottica stocastica tridimensionale (3D-STORM) per la visualizzazione su scala nanometrica della mineralizzazione del collagene in un modello di fibrilla autoassemblata a collagene di tipo I ricombinante. Il metodo consente l'imaging simultaneo di collagene, proteine non collagene (ad esempio, solfato di condroitina) e minerali di fosfato di calcio. La preparazione del campione prevede l'amminosilizzazione e l'autoassemblaggio del collagene, seguita dalla mineralizzazione utilizzando un mezzo a base di fosfato di calcio che forma fosfato di calcio amorfo (ACP) in una fase iniziale (30 minuti) e matura in idrossiapatite (HAP) entro 6 ore. Viene quindi eseguita una marcatura multiplexata con immunofluorescenza e i campioni vengono prima valutati con microscopia confocale prima dell'acquisizione dell'immagine 3D-STORM utilizzando un buffer di imaging a ricavo di ossigeno. L'elaborazione e l'analisi dei dati vengono effettuate utilizzando software pubblicamente disponibile. Rispetto alla microscopia elettronica o confocale convenzionale, questo protocollo combina specificità molecolare con risoluzione su scala nanometrica (precisione laterale tipica 20–30 nm, assiale 50–60 nm), permettendo la visualizzazione tridimensionale dei modelli di mineralizzazione intrafibrillare rispetto a quelli extrafibrillari. I risultati rappresentativi mostrano una chiara visualizzazione delle reti di collagene, delle proteine non collagene associate e delle fasi minerali nello spazio tridimensionale. Metriche quantitative, tra cui il coefficiente di correlazione di Pearson (0,89 ± 0,04) e il coefficiente di sovrapposizione di Manders (0,91 ± 0,03), sono forniti nella sezione Risultati. Questo protocollo offre uno strumento potente per i ricercatori in scienza dei biomateriali, biomineralizzazione e ingegneria tissutale ossea che necessitano di una conoscenza su scala nanometrica della dinamica della mineralizzazione.

Introduction

La mineralizzazione del collagene è un processo biologico fondamentale e fondamentale nella formazione di tessuti duri come ossa e denti¹. La struttura intricata delle fibre di collagene, unita a una regolazione finemente calibrata della deposizione minerale, conferisce a questi tessuti una notevole resistenza meccanica e un'integrità^{strutturale 2}. Il collagene non funge solo da impalcatura passiva, ma come partecipante attivo, orchestrando una deposizione precisa di minerali attraverso complesse interazioni molecolari^{e fisiche 3}. Chiarire questi meccanismi è fondamentale per comprendere condizioni patologiche come l'osteoporosi e la carie dentale, e per sviluppare materiali biomimetici per terapie^{rigenerative 4}.

Il diametro delle fibre di collagene nei tessuti duri varia da circa 50 a 100 nm, con le particelle di idrossiapatite (HAP) ancora più piccole (tipicamente spesse 2–5 nm e lunghe 20–30 nm) e intercalate all'interno di spazi^{fibrillari 5}. Sebbene le zone gap possano agire come siti di nucleazione, nei tessuti nativi i minerali inizialmente si formano negli spazi interfibrillari e successivamente si espandono in compartimenti intrafibrillari. I metodi tradizionali di caratterizzazione includono la colorazione istologica, la microscopia a scansione laser^{confocale 6,7} e la microscopia^{elettronica 8,9}. La colorazione istologica fornisce una valutazione macroscopica ma non può valutare gli stati di mineralizzazione su scala nanometrica. La microscopia confocale consente l'osservazione di componenti specifici ma è limitata dalla diffrazione (~200 nm lateralmente), incapace di risolvere la mineralizzazione intrafibrillare rispetto^{all'extrafibrillare 10}. La microscopia elettronica offre alta risoluzione ma manca di specificità molecolare. Sebbene la marcatura immunogold possa fornire specificità molecolare per la microscopia elettronica, richiede un trattamento specializzato ed è meno adatta alla visualizzazione multiplexata e tridimensionale di più componenti rispetto a STORM, e comporta lunghi cicli sperimentali e costi^{elevati 11}.

La microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM) supera il limite di diffrazione localizzando i singoli fluorofori con alta precisione, raggiungendo una risoluzione laterale di ~20 nm¹². Rispetto ad altre tecniche di super-risoluzione come la microscopia a esaurimento di emissione stimolata (STED⁾¹³e la microscopia a illuminazione strutturata (SIM⁾¹⁴, STORM offre una maggiore precisione di localizzazione (~20 nm lateralmente e ~50 nm assiale) ed è compatibile con una gamma più ampia di fluorofori organici. In particolare, STED richiede coloranti specializzati e potenti laser elevate che possono danneggiare campioni biologici, mentre SIM offre solo una risoluzione di ~100 nm, insufficiente per risolvere caratteristiche a scala fibrillale (50–100 nm). STORM offre un equilibrio pratico tra risoluzione, capacità di multiplexing e compatibilità dei campioni. Le linee guida pubblicate hanno descritto campioni di test standardizzati per facilitare l'ottimizzazione dei parametri di imaging STORM e la valutazione della^{risoluzione 15}. Quando combinato con capacità di imaging tridimensionale, 3D-STORM consente la visualizzazione su scala nanometrica di più componenti^{simultaneamente 16}. I recenti progressi hanno esteso STORM all'imaging multicolore e multiplexato, permettendo la visualizzazione di più bersagli all'interno dello stesso^{campione 17,18}.

Questo protocollo utilizza un modello biomimetico in vitro basato su fibrille di collagene di tipo I ricombinanti autoassemblate ed è esplicitamente progettato per modelli di fibrilla autoassemblati in vitro con collagene ricombinante di tipo I per distinguere la mineralizzazione intrafibrillare da quella extrafibrillare su scala nanometrica. Non è adatto per l'imaging di cellule vive, poiché STORM richiede campioni fissi e buffer che assorbono ossigeno. Non è inoltre adatta per tessuti nativi altamente mineralizzati (ad esempio, ossa mature) senza una precedente decalcificazione o prelievo di antigeni. Se è necessario valutare solo la densità minerale complessiva o la morfologia su grandi aree, la microscopia confocale convenzionale o elettronica è più efficiente.

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro standardizzato e a passo per l'uso del 3D-STORM multicolore per visualizzare la distribuzione su scala nanometrica di minerali e proteine non collagene all'interno delle singole fibrille di collagene, con particolare enfasi sulla distinzione tra mineralizzazione intrafibrillare ed extrafibrillare. Questo protocollo integra un'immunomarcatura ottimizzata con un buffer di imaging su misura per consentire il tracciamento simultaneo di più componenti organici (collagene, proteine non collagene) e fasi inorganiche (ACP, HAP) in tre^{dimensioni 19}. Un'innovazione chiave è la valutazione quantitativa dei modelli di mineralizzazione intrafibrillare rispetto a quelli extrafibrillari. La quantificazione avviene tramite due criteri indipendenti: (1) calcolare il coefficiente di colocalizzazione di Pearson tra i canali minerali (un colorante indicatore di calcio (ad esempio, calcina)) e collagene (un colorante fluorescente di un rosso profondo) utilizzando il modulo di colocalizzazione nel software di analisi delle immagini (coefficiente >0,8 indica forte associazione); (2) analizzare la persistenza del segnale minerale attraverso le Z-slice delle singole fibrille: se il segnale minerale è presente nelle fette centrali (Z = 0 a ±120 nm dal centro verticale della fibrilla) a intensità ≥50% del massimo, viene classificato come intrafibrillare. A differenza della microscopia elettronica o confocale convenzionale, questo protocollo combina specificità molecolare con risoluzione su scala nanometrica, consentendo una distribuzione spaziale tridimensionale della mineralizzazione intrafibrillare.

Questo protocollo è progettato per ricercatori in scienza dei biomateriali, biomineralizzazione e ingegneria tissutale ossea che necessitano di conoscenze su scala nanometrica sulla dinamica della mineralizzazione. La procedura standardizzata può anche essere adattata allo studio di altri sistemi mineralizzati di collagene, come fette di dentina demineralizzate o idrogel a base di collagene, regolando di conseguenza le fasi iniziali di preparazione del campione.

Protocol

Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto campioni biologici sono stati condotti secondo le linee guida e i regolamenti delle Strutture Centrali della Facoltà di Medicina dell'Università di Zhejiang e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza (Certificato di Approvazione n. BSL20235710079). Il protocollo sperimentale descritto qui utilizza reagenti di provenienza commerciale e sistemi biomimetici in vitro. Non coinvolge partecipanti umani, soggetti animali o campioni di tessuto umano, e quindi non richiede l'approvazione etica di un comitato di revisione istituzionale.

ATTENZIONE: Tutte le procedure che coinvolgono sostanze chimiche pericolose devono essere eseguite in una cappa con attrezzature di protezione individuale appropriate (camice da laboratorio, guanti, occhiali di sicurezza). Smaltire i rifiuti chimici secondo le normative istituzionali. Per il NaN₃, raccogliere i rifiuti in un contenitore dedicato contrassegnato come "rifiuti azidici" e non mescolarli con acidi (rischio di gas esplosivi). Per il glutaraldeide, inattivare con un eccesso del 10% di bisolfito di sodio prima dello smaltimento. Per il β-mercaptoetanolo, ossida con candeggina (1:10 v/v) per 1 ora prima dello smaltimento dello scarico.

NOTA: La marcatura con immunofluorescenza DEVE essere eseguita PRIMA della mineralizzazione per evitare il mascheramento degli epitopi da parte dei depositi minerali. Per applicazioni che richiedono la marcatura post-mineralizzazione, può essere necessario il recupero di antigeni.

1. Preparazione del mezzo mineralizzato

1. Preparazione di un mezzo mineralizzato per fibrille di collagene ricostituite
   1. Prepara la soluzione di calcio aggiungendo 100 μL di acido poliaspartico da 5 mg/mL (p-Asp, Mw 9-11 kDa) a goccia a 5 mL di soluzione CaCl₂ da 3,44 mM in un tubo conico da 15 mL.
   2. Il vortice si mescola nel tubo per 30 secondi fino a diventare omogeneo.
   3. Aggiungi lentamente p-Asp e mescola accuratamente per stabilizzare il fosfato di calcio amorfo (ACP).
   4. Aggiungere 5 mL di soluzione fosfatica (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) alla soluzione di calcio.
   5. Miscela vortice per 1 minuto.
      NOTA: Concentrazioni finali dopo la miscelazione: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl e 50 μg/mL p-Asp.
   6. Prepara il mezzo di mineralizzazione immediatamente prima dell'uso. Non conservare; utilizzare immediatamente il precursore instabile dell'ACP per ottenere risultati coerenti.
      NOTA: La conservazione porta a una cristallizzazione prematura.
2. Preparazione di mezzo mineralizzato per gel di collagene/dentina demineralizzata
   1. Prepara una soluzione contenente calcio sciogliendo 8,77 g di NaCl, 0,01 g di NaN₃, 6,06 g di Tris e 1,11 g di CaCl₂ in acqua deionizzata da 800 mL.
   2. Porta il volume a 1 L con acqua deionizzata.
   3. Aggiungere 350 μg/mL di acido poliacrilico (PAA, Mw ~1800) alla soluzione contenente calcio.
   4. Vortice per 1 minuto.
      NOTA: Usa PAA invece di p-Asp per una migliore stabilizzazione a concentrazioni di calcio più elevate.
   5. Preparare la soluzione fosfatica sciogliendo 0,85 g di Na₂HPO₄ in 1 L di acqua deionizzata per ottenere 6 mM di Na₂HPO₄.
   6. Sterilizza la soluzione di fosfato tramite filtri utilizzando una membrana da 0,22 μm.
   7. Combinare volumi uguali (ad esempio, 500 mL ciascuno) di soluzioni di calcio e fosfato con mescolamento magnetico a 300 giri/min.
   8. Regola il pH a 7,4 usando 1 M HCl o NaOH mentre monitori con un misuratore di pH.
      NOTA: Mantieni il pH a 7,4 ± 0,1. Non permettere deviazioni di pH >0,2, che causano cristallizzazione prematura.

2. Preparazione delle fibre di collagene ricombinanti

1. Ammino-silanizzazione di piatti con fondo di vetro
   NOTA: Questo trattamento utilizza (3-aminopropil) trietossisilano (APTES) per introdurre gruppi amminosi carichi positivamente (-NH₂) sulla superficie del vetro, favorendo l'adsorbimento elettrostatico e la stabilizzazione dei monomeri di collagene carichi negativamente.
   1. Aggiungere 200 μL di soluzione APTES (5% v/v in etanolo assoluto) a ogni piatto di coltura con fondo di vetro (35 mm, spessore #1,5H, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Assicurati di coprire completamente la superficie del piatto con la soluzione APTES.
   3. Incubare al buio per 2 ore a temperatura ambiente (20–25 °C).
   4. Risciacqua i piatti tre volte con etanolo assoluto (2 mL per lavaggio).
   5. Ultrasonica in acqua deionizzata per 10 minuti a 40 kHz. Rimuovere completamente gli APTES residui per prevenire il legame non specifico.
   6. Piatti silanizzati possono essere conservati asciutti a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
   7. (Opzionale) Cuocere per una maggiore stabilità: Metti i piatti lavati e asciugati in forno a 100–120 °C per 30–60 minuti.
   8. Lascia raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere.
      NOTA: Se si usano piatti di plastica, abbassare la temperatura sotto gli 80 °C per prevenire deformazioni. Adatta la procedura di silanizzazione di Bitter e Muir²⁰.
2. Autoassemblaggio del collagene e reticolazione
   1. Pipetta 100 μL di soluzione di collagene-I (50 μg/mL in 0,1 M acido acetico) su ciascun piatto silanizzato.
   2. Incubare a 37 °C per 10 ore in una camera di umidità (> 90% di umidità relativa). Mantieni un'umidità stabile per prevenire l'evaporazione della soluzione.
   3. Verificare la formazione della fibrilla con microscopia a contrasto di fase o confocale; Una preparazione efficace mostra una rete di fibrille fine, simile a una ragnatela.
   4. Per verificare la corretta formazione della fibrilla a livello ultrastrutturale, preparare un campione separato su una griglia TEM formale/rivestita di carbonio in polivinile, seguendo le stesse condizioni di autoassemblaggio (collagene-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 h, umidità > 90%).
   5. Tingi con acido fosfotongstico all'1% (pH 7,0) per 10 minuti.
   6. Lava con acqua deionizzata.
   7. Esamina sotto un microscopio elettronico a trasmissione. La fibrillogenesi riuscita è indicata dal caratteristico schema di bande periodica D a 67 nm (vedi Figura 3).
   8. Aspira con cura la soluzione residua di collagene dai vasi con fondo di vetro.
   9. Aggiungi 2 mL di soluzione di solfato di condroitina (CS) (50 mg/mL in PBS, pH 5,5) in ogni piatto.
   10. Incubare a 4 °C per 12 ore per permettere l'adsorbimento elettrostatico del CS sulle fibrille di collagene.
   11. Preparare la soluzione di reticolazione EDC/^{NHS 21}: dissolvere 0,2 M EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimide) e 0,05 M NHS (N-idrossisuccinimide) in tampone MES (0,1 M MES, pH 5,5).
       NOTA: Il tampone MES può essere preparato dissolvendo l'acido libero MES in acqua deionizzata e regolando il pH a 5,5 con NaOH.
   12. Rimuovi la soluzione CS e aggiungi 2 mL della soluzione di reticolazione EDC/NHS.
   13. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore per immobilizzare covalentmente la CS sul collagene.
   14. Lava i piatti tre volte con PBS (5 mL ciascuno, 5 min ciascuno) per rimuovere i reagenti non reattivi.
   15. Conservare le fibre di collagene lavorate in PBS a 4 °C per un massimo di 24 ore prima della mineralizzazione.

3. Marcatura immunofluorescenza (eseguita PRIMA della mineralizzazione)

1. Preparazione del campione
   1. Risciacquare le fibrille di collagene tre volte con una soluzione di NaCl da 500 mM (10 mL per lavaggio, 5 min ciascuno).
   2. Lava tre volte con acqua deionizzata (10 mL per lavaggio, 5 min ciascuno).
   3. Esegui i lavaggi su una piattaforma oscillatrice orizzontale che ruota a 50 giri/min per garantire un lavaggio accurato minimizzando le forze di taglio che potrebbero staccare le fibrille assemblate.
2. Blocco e incubazione primaria degli anticorpi
   1. Incubare con tampone bloccante (albumina sierica bovina al 5% in PBS) a 37 °C per 1 ora in una camera umidificata.
   2. Prepara un cocktail di anticorpi in tampone bloccante: anti-collagene-I di coniglio (diluizione 1:100) e solfato anticondroitina del topo (diluizione 1:100).
   3. Aggiungi 200 μL di cocktail di anticorpi per campione.
   4. Copri i campioni con pellicola sigillante da laboratorio.
   5. Incubare a 4 °C durante la notte (12–16 ore).
   6. Proteggi dalla luce usando la carta stagnola. Dopo l'incubazione primaria degli anticorpi, i campioni possono essere conservati in PBS a 4 °C per un massimo di 24 ore.
3. Colorazione secondaria degli anticorpi
   1. Rimuovere gli anticorpi primari non legati lavando i piatti tre volte con il tampone di lavaggio (0,1% Tween-20 in PBS), 10 minuti per ogni lavaggio.
   2. Preparare la miscela secondaria di anticorpi fluorescenti in un tampone bloccante (200 μL per piatto da 35 mm) contenente: IgG anti-coniglio di capra coniugato a un colorante fluorescente rosso profondo (1:100) e IgM anti-topo di capra coniugato a un colorante fluorescente rosso (1:100).
      NOTA: Da questo passaggio in poi, proteggi i campioni dalla luce per prevenire il fotosbiancamento del fluoroforo.
   3. Incubare i campioni a temperatura ambiente (20–25 °C) per 1 ora al buio.
   4. Lavare i piatti tre volte con il tampone per lavaggio (10 min ciascuno) per rimuovere gli anticorpi secondari non legati.
      NOTA: Conservare i campioni etichettati in PBS a 4 °C (protetti dalla luce) per un massimo di 48 ore prima dell'imaging (imaging). Includere controlli senza anticorpi primari per verificare l'autofluorescenza.

4. Mineralizzazione delle fibre di collagene (eseguita DOPO l'etichettatura)

1. Processo di mineralizzazione
   1. Aggiungi 2 mL di substrato mineralizzato appena preparato per ogni piatto.
   2. Incubare a 37 °C per 30 minuti (a breve termine) per la formazione minerale in fase iniziale (ACP).
   3. In alternativa, incubare a 37 °C per 6 ore (a lungo termine) per la cristallizzazione del minerale maturo (HAP).
      NOTA: Mantieni la temperatura esatta a 37 °C ± 0,5 °C utilizzando un incubatore calibrato.
   4. Aspira delicatamente il mezzo mineralizzato.
   5. Risciacqua tre volte con acqua deionizzata (5 mL per lavaggio, intervalli di 1 minuto).
2. Marcatura con fosfato di calcio
   1. Aggiungere 4 μM di un colorante indicatore di calcio (ad esempio, calcina) in PBS (200 μL per piatto).
   2. Incubare a temperatura ambiente (20–25 °C) per 30 minuti al buio.
      NOTA: Il colorante indicatore del calcio (ad esempio, calcina) si lega agli ioni calcio e non discrimina tra fasi amorfa e cristallina; l'assegnazione delle fasi si basa sul tempo di mineralizzazione (30 min = ACP, 6 h = HAP). Dovrebbe essere protetto dalla luce tramite tubi ambrati o pellicola stagnola.
   3. Risciacquo cinque volte: tre lavaggi con acqua deionizzata e due lavaggi con etanolo al 70% (1 minuto ciascuno), alternandosi tra i due.
3. Preparazione del campione per l'imaging
   1. Immergi i campioni in un tampone di imaging: glicerolo al 10% (c/v) in PBS. Opzionalmente aggiungi un reagente antifade secondo le istruzioni del produttore.
   2. Applicare un volume sufficiente (20–50 μL) di tampone per immagini per coprire il campione.
   3. Posiziona una copertura sopra il campione.
   4. Conserva i campioni a 4 °C al buio per un massimo di 72 ore.

5. Osservazione sotto microscopio confocale laser

1. Trasferimento di campioni da 4 °C a temperatura ambiente (20–25 °C).
2. Lascia 10 minuti di equilibrio per evitare la condensa.
3. Mantieni una protezione leggera usando contenitori ambrati o pellicola stagnola.
4. Verifica che il buffer di imaging copra l'intero campione.
5. Configura il microscopio confocale con le seguenti impostazioni:
   1. Per l'imaging del collagene (colorante fluorescente rosso profondo): laser a 647 nm, filtro a emissione da 650-710 nm.
   2. Per l'imaging con fosfato di calcio (colorante indicatore di calcio (ad esempio, calcina)): laser da 488 nm, filtro a emissione da 500-550 nm.
   3. Obiettivo: immersione in olio del 100× (NA 1,4).
   4. Diametro del foro stenopeico: 1 unità Airy (AU).
   5. Tempo di permanenza dei pixel: 1-2 μs.
      NOTA: Eseguire l'allineamento laser e la calibrazione dei fori stenopeici prima dell'immagini.
6. Eseguire scansione sequenziale: prima scansione con eccitazione a 647 nm (collagene).
7. Eseguire una seconda scansione con eccitazione a 488 nm (minerale).
   NOTA: Raccogli i canali in sequenza per evitare il flusso di sangue.
8. Per la ricostruzione 3D, impostare la dimensione del passo dello stack Z a 0,5 μm o meno per garantire un campionamento adeguato.
9. Salva file con i metadati preservati.
10. Per l'analisi di localizzazione, si utilizzano software di analisi delle immagini in grado di calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson (ad esempio, software pubblicamente disponibile con plugin adeguati).

6. Imaging tramite microscopia ottica stocastica tridimensionale (3D-STORM)

1. Preparazione del buffer di imaging^{STORM 22}
   NOTA: Glucosio ossidasi e catalasi vengono aggiunte al tampone di imaging per recuperare ossigeno, riducendo così lo sbiancamento fotosbiancante e prolungando il battito di ciglia dei fluorofori, essenziale per la localizzazione di singole molecole in STORM.
   1. Prepara una soluzione di stock di glucosio ossidasi (GOx) a 8 mg/mL in un tampone di acetato di sodio da 50 mM (pH 5,1).
   2. Prepara una soluzione di calcio di catalasi a 160 μg/mL in 1× PBS.
      NOTA: Aliquota le scorte enzimatiche, si congelano subito usando azoto liquido o un bagno di ghiaccio secco/etanolo, conservandoli a -20 °C o -80 °C. Evita cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
   3. Preparare un nuovo buffer di imaging STORM sul ghiaccio, protetto dalla luce.
   4. Combinare i seguenti componenti nell'ordine indicato per un volume finale di 1 mL: H₂O sterile senza nucleasi (fino a 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM finale), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM finale), 1 M di cisteamina (MEA) appena preparata e regolata a pH ~7,0 (50 μL, 50 mM finale), 50% (v) glucosio (200 μL, 10% in peso e valore finale), calcio GOx (200 μL, finale 1,6 mg/mL), calcio di catalasi (200 μL, 32 μg/mL finale).
   5. Mescola delicatamente tramite pipettaggio o inversione. Non fare vortice.
      NOTA: Il buffer deve essere preparato fresco e mantenuto sul ghiaccio protetto dalla luce. Da usare entro 30 minuti dalla preparazione. Per un'ottimizzazione dettagliata delle condizioni di imaging STORM, si riferisce ai protocolli stabiliti utilizzando i campioni^{di test 15}.
   6. Aggiungere 200 μL di tampone di imaging STORM appena preparato per coprire completamente il campione.
2. Configurazione del sistema 3D-STORM
   1. Assicurarsi che il percorso di imaging sia indirizzato a una fotocamera CCD a moltiplicazione di elettroni (EMCCD).
   2. Attiva il modulo dell'obiettivo cilindrico per l'imaging 3D.
   3. Imposta il software in modalità acquisizione 3D STORM.
   4. Configura i filtri di percorso ottici per i coloranti utilizzati.
   5. Accendi il laser a 647 nm e imposta la potenza a un livello basso (1-5 mW).
   6. Utilizzando un obiettivo di immersione in olio del 100× (NA ≥1.4), individua la regione di interesse in modalità widefield o TIRF live ante.
   7. Acquisire un'immagine convenzionale a fluorescenza a campo ampio per un confronto successivo.
   8. Passa alla modalità illuminazione TIRF.
   9. Calibrare l'angolo TIRF per ottenere un campo di illuminazione sottile (~100-200 nm) per minimizzare la fluorescenza di fondo.
   10. Regola il tempo di esposizione della fotocamera (10-30 ms) in base all'intensità iniziale del segnale.
   11. Regolare la potenza del laser d'imaging in base all'intensità iniziale del segnale.
   12. Esegui una breve prova di acquisizione.
   13. Verifica che i parametri siano impostati correttamente senza causare un rapido fotosbiancamento.
       NOTA: Assicurarsi un allineamento preciso dell'asse cilindrico della lente con il piano del campione. La maggior parte dei sistemi moderni dispone di calibrazione automatica. Per la calibrazione manuale, utilizzare sfere fluorescenti da 100 nm per verificare le funzioni di espansione simmetrica e rotonda (PSF).
   14. Si inizia con un'esposizione di 10–30 ms a una potenza laser di 647 nm di 1–2 kW/^cm2.
   15. Verifica che la densità di lampeggiamento sia 0,1–1 molecola/^{μm 2}.
   16. Se la densità è troppo bassa o troppo alta, regola di conseguenza la potenza del laser o il tempo di esposizione.
   17. Ripetere la verifica e l'aggiustamento fino a raggiungere la densità ideale.
3. Acquisizione dati 3D-STORM
   1. Imposta il software di acquisizione in modalità "Attivazione Continua".
   2. Imposta il laser di imaging (647 nm) ad alta potenza (fibra di ingresso 100-500 mW) per far passare la maggior parte dei fluorofori allo stato scuro.
   3. Imposta il laser di attivazione (405 nm) su bassa potenza (0,1–5 mW).
   4. Ottimizzare empiricamente la potenza di 405 nm per mantenere 100–200 molecole localizzate per fotogramma in una regione di 256×256 pixel.
   5. Imposta il numero totale di fotogrammi a 10.000–20.000.
   6. Usa 1 fotogramma di luce di attivazione (405 nm) seguita da 5 fotogrammi di luce di imaging (647 nm) per ciclo.
   7. Inizia l'acquisizione.
   8. Operare EMCCD con massima sensibilità (guadagno EM applicato)
   9. Usa un'esposizione di 10–30 ms per fotogramma.
   10. Durante l'acquisizione, monitorare la densità delle molecole attive.
   11. Regolare la potenza laser a 405 nm per mantenere un flusso costante di eventi a singola molecola.
       NOTA: I dati grezzi del film possono essere memorizzati su un hard disk standard per l'archiviazione a lungo termine prima della ricostruzione.
4. Analisi dei dati della mineralizzazione del collagene (utilizzando software di analisi delle immagini con modulo STORM)
   1. Nel software di analisi, seleziona il driver della fotocamera appropriato (modulo STORM).
   2. Clicca su [Interfaccia grafica di analisi] nel pannello STORM. Si apre la finestra di analisi.
   3. Clicca su [Apri file]. Seleziona il file immagine grezzo della microscopia da analizzare. Clicca su Open.
   4. Determinare il valore minimo di fluorescenza (Altezza Minima) per segnali validi.
   5. Trova il punto più scuro ancora riconoscibile come un segnale a singola molecola.
   6. Sposta il mouse al centro.
   7. Leggi il valore di altezza di picco.
   8. Annota questo valore.
   9. Clicca su [Impostazioni identificazione]. Nel dialogo, imposta i seguenti parametri: Altezza Minima (inserisci il valore registrato nel passo 6.4.8), Altezza Massima (20000), Base CCD (100) e per i dati 3D-STORM controlla "3D" (deseleziona per 2D).
   10. Clicca >> per espandere altri parametri. Impostato: larghezza minima (nm) a 200, larghezza massima (nm) a 700 (400 per 2D), larghezza di adattamento iniziale (nm) a 300, rapporto assiale massimo a 2,5 (1,3 per 2D) e spostamento massimo (pix) a 1.
   11. Clicca su OK per chiudere il dialogo.
   12. Esegui un'analisi di prova per convalidare i parametri. Disattiva la correzione della deriva.
   13. Imposta i punti a 1.
   14. Clicca su [Test].
   15. Dopo l'analisi, clicca su OK nella finestra di dialogo pop-up.
   16. Controlla che i punti segnali siano correttamente identificati. Il rumore di fondo non dovrebbe essere selezionato male. I veri punti da non perdere.
   17. Se insoddisfacente, ripetere i passaggi 6.4.9–6.4.16 per regolare i parametri fino a quando non sono corretti.
   18. Dopo che l'analisi di prova è stata superata, esegui l'analisi completa. Controlla la correzione della deriva.
       NOTA: Il software di analisi esegue la correzione della deriva utilizzando un algoritmo di correlazione incrociata ridondante (RCC) che massimizza la correlazione tra segmenti temporali di localizzazione molecolari. Non sono richieste perline^{fiduciali 23}.
   19. Mantenere i Punti = 1.
   20. Clicca su [Start] (o clicca di nuovo su [Test], poi su [Start]).
   21. Aspettare che l'analisi venga completata. Clicca su OK nella finestra pop-up.
   22. Dopo l'analisi, due file di risultati (.bin e .txt) vengono generati nella stessa cartella del file .nd2.
   23. Per l'analisi di colocalizzazione (canali da 647 nm e 488 nm), visualizza entrambi i canali simultaneamente nella lista dei canali della finestra di analisi.
   24. Seleziona una regione di interesse (ROI) appropriata.
   25. Usa il modulo di colocalizzazione per calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson. Se non viene fornito automaticamente, esportare manualmente i dati della nuvola di punti in un plugin di colocalizzazione in un software di analisi delle immagini pubblicamente disponibile. Annota il valore.
   26. Eseguire l'analisi Z-slice per confermare la mineralizzazione intrafibrillare. Nel menu principale, seleziona Visualizza > passo Z > Slice.
   27. Estrarre i singoli piani a intervalli di 60 nm.
   28. Osserva il segnale minerale (verde, canale 488 nm). Controlla se il segnale persiste nelle fette centrali (Z = 0 nm ±120 nm). La persistenza conferma la mineralizzazione intrafibrillare.
   29. Opzionale: eseguire il filtraggio della densità per ridurre il sovraconteggio da parte di emettitori densamente impacchiati. Apri l'immagine ricostruita di STORM in un software di analisi d'immagine pubblico utilizzando un plugin per l'analisi della localizzazione a singola^{molecola 24}.
   30. Per ridurre il sovraconteggio da parte di emettitori densamente impacchettati, applica un filtraggio di densità (ad esempio, filtro mediano o soglia locale di densità) basato sulla densità del segnale.
   31. Se la correzione della deriva non è stata abilitata nel passo 6.4.18 o è necessaria una correzione aggiuntiva, esegui la correzione della deriva. Corretto in base al PSF dei marcatori fiduciari. In alternativa, si usano algoritmi di correlazione incrociata (ad esempio, correzione di deriva implementata nello stesso plugin).
   32. Eseguire la dismescolazione spettrale per eliminare la diafonia del canale. Nella finestra di analisi STORM, clicca sullo strumento di rimozione diafona (di solito nell'angolo in basso a destra).
   33. Imposta il raggio a 25,0 nm (consigliato). Seleziona il canale sorgente. Seleziona il metodo di rimozione: si raccomanda la statistica.
   34. Per rimuovere l'attivazione incrociata causata dal laser di eccitazione, seleziona Sottrae oltre a NSA > Attivazione incrociata. Clicca OK. Un nuovo canale, Nonspecific Activation-Xt, viene generato automaticamente.
   35. Validare i livelli di autofluorescenza e i segnali di fondo utilizzando campioni di controllo non colorati. Assicurati che tutti i segnali siano etichettati specificamente.
   36. Esegui la visualizzazione 3D. Seleziona una regione di interesse (ROI) nella finestra di analisi.
   37. Clicca sul pulsante [3D] (o [Mostra 3D]). Genera una proiezione 3D o un rendering volumetrico.
   38. Clicca con il tasto destro per regolare i parametri di rendering. Esporta i video in formati comuni (ad esempio, .avi o .mp4).
   39. Per classificare un segnale minerale come intrafibrillare, si esegue l'analisi Z-slice come in 6.4.26–6.4.28. Profili di intensità di esportazione.
   40. Definisci il centro della fibrilla come il piano Z, dove il segnale del collagene è il massimo.
   41. Un segnale minerale è considerato intrafibrillare se la sua intensità a Z = 0 (centro) e a Z = ±60 nm corrisponde al ≥50% dell'intensità massima minerale presente in quella fibrilla. Se il segnale scende sotto il 30% a Z = 0, classificati come extrafibrillare.
   42. Registra la classificazione per almeno 50 fibrille per condizione per calcolare la percentuale di mineralizzazione intrafibrillare.
       NOTA: Sono disponibili anche plugin alternativi pubblicamente disponibili per il filtraggio della densità, la correzione della deriva e il dismix spettrale.

Results

L'implementazione con successo di questo protocollo produce una visualizzazione tridimensionale ad alta risoluzione delle fibrille di collagene mineralizzate utilizzando 3D-STORM multicolore. I seguenti risultati illustrano risultati tipici, controlli di qualità e valutazioni quantitative.

La Figura 1 mostra una ricostruzione multicolore 3D-STORM di una rete di collagene mineralizzata con fosfato di calcio amorfo (ACP). Il collage...

Discussion

Questo protocollo offre un flusso di lavoro completo per la visualizzazione su scala nanometrica della mineralizzazione del collagene utilizzando il multicolore 3D-STORM. Diversi passaggi critici richiedono particolare attenzione per garantire risultati positivi.

Innanzitutto, la preparazione del campione è fondamentale per l'imaging di alta qualità di STORM. L'amino-silanizzazione delle piastre con fondo di vetro deve essere accurata per garantire un attacco ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido poliaspartico (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Stabilizzatore per fosfato di calcio amorfo
Cloruro di calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Fonte di calcio
Fosfato disodico di sodio (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Fonte di fosfato
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Aggiustamento della forza ionica
Acido poliacrillico (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Stabilizzatore per calcio ad alta concentrazione
Base di tris	Sigma-Aldrich	T1503	Componente del buffer
Azido di sodio (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Agente antimicrobico
(3-Aminopropil)trietossisilane (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Agente di funzionalizzazione della superficie del vetro
Etanolo assoluto	Sigma-Aldrich	459836	Solvente
Soluzione di collagene di tipo I (50 μg/mL in acido acetico 0,1 M)	Corning	354249	Scafandro auto-assemblabile
Solfato di condroitina (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Mimica di proteine non collagene
EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimmide)	Sigma-Aldrich	E7750	Rete incrociata
NHS (N-idrossisuccinimide)	Sigma-Aldrich	130672	Attivatore della reticolazione
Acido libero MES	Sigma-Aldrich	M5287	Buffer per la reticolazione
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	10010023	Buffer di lavaggio e diluizione
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Agente di bloccaggio
Anticorpo anti-collagene-I di coniglio	Abcam	ab34710	Anticorpo primario per collagene
Anticorpo anti-solfato di condroitina di topo	Sigma-Aldrich	C8035	Anticorpo primario per CS
IgG anti-coniglio di capra coniugata a colorante fluorescente rosso lontano (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Anticorpo secondario per collagene
IgM anti-topo di capra coniugato a colorante fluorescente rosso (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Anticorpo secondario per CS
Calcein (colorante indicatore di calcio)	Sigma-Aldrich	C0875	Etichetta di fosfato di calcio
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Detergente per il buffer di lavaggio
Glicerina	Sigma-Aldrich	G5516	Componente del buffer di imaging
Ossidasi del glucosio (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Assorbente di ossigeno
Catalasi	Sigma-Aldrich	C1345	Assorbente di ossigeno
Cisteamina (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Tiolo per il lampeggiamento del fluoroforo
D-Glucosio	Sigma-Aldrich	G6152	Substrato per ossidasi del glucosio
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S2889	Buffer per GOx stock
Acido cloridrico (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Aggiustamento del pH
Idrossido di sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Aggiustamento del pH
Acido fosfotungstenico	Sigma-Aldrich	P4006	Tintura negativa per TEM
Piatti di coltura con fondo in vetro (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Substrato del campione; spessore 0,17 mm
Detergente ad ultrasuoni (40 kHz)	Branson	B200	Dispositivo di pulizia
Camera di umidità	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Per l'auto-assemblaggio del collagene
Microscopio elettronico a trasmissione	Hitachi	HT7800	Imaging TEM
Griglie TEM rivestite in Formvar/carbonio (200 mesh)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Supporto del campione TEM
Piattaforma di shaker orizzontale	Labnet	S2030-RC	Lavaggio delicato
Microscopio confocale a scansione laser	Nikon	A1	Screening preliminare
Sistema microscopio 3D-STORM (con laser 405/488/647 nm, lente cilindrica, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Imaging a super risoluzione
Obiettivo a immersione in olio 100× (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Imaging ad alta risoluzione
pH-metro	Mettler Toledo	FiveGo F2	Controllo del pH
Software di acquisizione e analisi STORM	Nikon	NIS-Elements (modulo STORM)	Acquisizione e elaborazione dei dati STORM
Formato di file.nd2 (file immagine microscopia raw)	Nikon	N/A	Formato di file immagine raw generato dai microscopi Nikon.
Software di analisi delle immagini disponibile pubblicamente	Open source	N/A	es. ImageJ con plugin ThunderSTORM per l'analisi di localizzazione a singola molecola (colocalizzazione, correzione della deriva)
Parafilm	Bemis	PM996	Copertura del campione durante l'incubazione
Carta stagnola	Qualsiasi fornitore di laboratorio	N/A	Per la protezione dalla luce (es. avvolgere i campioni)
Tubetti per microcentrifuga ambra	Fisher Scientific	05-669-21	Per la protezione dalla luce dei fluorofori
Coverslip (n. 1,5)	Corning	2855-18	Montaggio del campione