Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali
December 8th, 2010
Le cellule staminali pluripotenti in crescita in sospensione differenziarsi in corpi embrionali (EBS). Qui mostriamo come ottenere criosezioni EB alta qualità utile per lo studio di aspetti cellulari e molecolari della embriogenesi, pur mantenendo la propria organizzazione come aggregati.
Prima parte, Introduzione. Ciao, mi chiamo Rafael. Sono un postdoc presso il Professor Stevens Hans Lab dell'Università Federale di Rio de Janeiro in Brasile.
Ciao, mi chiamo Ismail. Sono assistente di ricerca, anche professore. In questo video, mostreremo come preparare sezioni chiare dei corpi Android.
Quindi iniziamo. Parte seconda, materiali e attrezzature. Per questa procedura, avremo bisogno di un mezzo di inclusione per i campioni congelati.
4%Soluzione di aldeide paraforme per la fissazione delle cellule, soluzioni di saccarosio per la crioprotezione. Un ago con la punta leggermente piegata, uno stereomicroscopio per una migliore visualizzazione dell'EBS e uno shaker. Parte terza.
Qui i corpi embrionali umani vengono coltivati in piastre di coltura non aderenti. Utilizzando una pipetta, raggruppiamo tutti i corpi embrionali il più vicino possibile per trasferirli in una provetta conica da 15 millilitri. Gli EBS vengono raccolti con cura e trasferiti nel tubo.
È importante raccogliere tutti gli ebs poiché non c'è una grande quantità di materiale Dopo che gli EBS sono stati travasati, il terreno di coltura viene accuratamente scartato. Dovresti essere in grado di vedere il pellet sul fondo del tubo. Ora possiamo procedere alla procedura di fissaggio.
L'EBS sarà fissato in soluzione aldeidica paraforma al 4% in PBS o soluzione salina tamponata con fosfato. È importante risospendere il pellet con una soluzione di PFA. Gli EBS vengono quindi fissati in soluzione di fissazione per 30 minuti.
Dopo il fissaggio, la soluzione di PFA viene accuratamente rimossa. Facendo attenzione a evitare che Resus sospenda l'EBS e lo sostituisca con una soluzione di saccarosio al 10% in PBS per avviare la crioprotezione dell'EBS, il materiale viene conservato per 30 minuti in questa soluzione. Successivamente, rimuoviamo con cura la soluzione di saccarosio al 10% e risospendiamo l'EBS in una soluzione di saccarosio al 20%.
Ancora una volta, gli EBS vengono conservati per 30 minuti in questa soluzione. Infine, la soluzione di saccarosio al 20% viene rimossa e sostituita da una soluzione di saccarosio al 30% in PBS dove viene conservata per altri 30 minuti. Ora possiamo procedere all'orientamento e al blocco di ebs.
Nel nostro laboratorio, utilizziamo gusci di capsule vuote come stampi. Per il blocco dell'ebs, è importante rivestire le pareti interne della punta con una soluzione di saccarosio prima di raccogliere l'ebs. Ora possiamo raccogliere con cura gli EBS e aspettare che decantino sul fondo della punta.
Successivamente, gli EBS vengono posizionati al centro del blocco. Questa dovrebbe essere la posizione finale di EBS all'interno del blocco. Con l'aiuto di uno stereomicroscopio e di una punta fine, raccogliamo e scarichiamo la maggior quantità possibile di soluzione di saccarosio.
Facendo sempre attenzione a non raccogliere gli ebs. Utilizzando un ago con la punta leggermente piegata, tutti gli EBS vengono posizionati al centro del blocco. Infine, la soluzione di saccarosio rimanente viene raccolta con pezzi di carta da filtro.
La posizione specifica dell'EBS all'interno del blocco è molto importante per ottenere fette di buona qualità. Ecco un esempio di cattivo posizionamento dell'EB all'interno della scocca. Dopo il posizionamento dell'EBS e la rimozione della soluzione di saccarosio, il guscio viene riempito con OCT a partire dai bordi, facendo sempre attenzione ad evitare che il Resus sospenda l'ebs.
Le bolle rimanenti vengono rimosse con una pipetta e i gusci vengono agitati per 15 minuti. Dopo l'agitazione. Il blocco OCT è congelato in ghiaccio secco.
A questo punto, è possibile conservare il blocco avvolto in un foglio di alluminio a meno 80 gradi Celsius per ulteriori analisi o procedere al criostato Parte quarta, Taglio. Per realizzare le sezioni criogeniche, avrai bisogno di una lama monouso o permanente, OCT e vetrini in polietilene L lisina. Il blocco OCT viene rimosso dal congelatore e conservato all'interno del criostato fino a quando non raggiunge meno 20 gradi Celsius.
Il blocco viene quindi posizionato sul supporto e allineato parallelamente al bordo della lama. I campioni di EB sono molto più piccoli della maggior parte degli altri campioni di tessuto, quindi è molto importante essere sicuri che l'intera superficie del blocco tocchi la lama allo stesso tempo, riducendo così al minimo la perdita di materiale. Dopo essere stato posizionato, il blocco viene tagliato in fette di 10 micrometri, che vengono raccolte direttamente sui vetrini.
I vetrini possono essere conservati, preferibilmente a meno 70 gradi Celsius, o possono essere utilizzati lo stesso giorno. Il materiale può essere colorato per l'immunoistochimica o l'immunofluorescenza. Conclusione. Il metodo qui descritto fornisce un protocollo ragionevolmente economico e facile da seguire per ottenere sezioni sottili di criostato di corpi embrionali sviluppati da linee di cellule staminali umane H nove o US P one di topo.
Le sezioni criogeniche risultanti possono essere utilizzate in un'ampia varietà di procedure al fine di analizzare l'espressione proteica o la morfologia dell'EB.
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Panoramica
Questo articolo dimostra il processo di ottenimento di criosezzioni di alta qualità di corpi embrionali (EB) derivati da cellule staminali pluripotenti coltivate in sospensione. Queste criosezzioni sono essenziali per studiare gli aspetti cellulari e molecolari dell'embriogenesi mantenendo l'organizzazione degli EB.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Embriogenesi
- Differenziaizone cellulare
Conoscenze di base
- Le cellule staminali pluripotenti possono differenziarsi in vari tipi di cellule.
- I corpi embrionali sono aggregati che imitano lo sviluppo embrionale precoce.
- Studiare gli EB aiuta a comprendere i meccanismi dell'embriogenesi.
- Le criosezzioni di alta qualità sono cruciali per un'analisi dettagliata.
Obiettivo dello studio
- Fornire un metodo per preparare criosezzioni di EB.
- Facilitare lo studio dei processi cellulari e molecolari durante la differenziazione.
- Preservare l'organizzazione strutturale degli EB nell'analisi.
Metodi utilizzati
- Preparazione di cellule staminali pluripotenti in coltura in sospensione.
- Induzione della differenziazione in corpi embrionali.
- Tecniche di criosezzionamento per ottenere campioni di alta qualità.
- Analisi delle caratteristiche cellulari e molecolari degli EB.
Principali risultati
- Preparazione di successo di criosezzioni da EB.
- Preservazione dell'organizzazione degli EB nelle criosezzioni.
- Migliorata capacità di studiare l'embriogenesi a livello cellulare.
- Metodo dimostrato applicabile a vari contesti di ricerca.
Conclusioni
- Il metodo permette un'analisi dettagliata degli EB.
- Le criosezzioni di alta qualità sono preziose per gli studi embrionali.
- Questo approccio può far progredire la comprensione della differenziazione delle cellule staminali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
