Soluzione di strutture della proteina fluorescente Cerulean utilizzando MeshAndCollect

Il protocollo automatizzato MeshAndCollect è stato sviluppato per combinare la cristallografia seriale con la raccolta standard dei dati di rotazione per misurare piccoli cristalli dai campioni di disco. Il metodo identifica prima la posizione dei cristalli montati sullo stesso portacampioni per poi dirigere la raccolta di set di dati parziali che verranno successivamente uniti e utilizzati per la soluzione della struttura. MeshAndCollect è avvincente in quanto consente di fare esperimenti rapidamente e con la stessa configurazione, soluzione di struttura, screening del ligando e tutto il genere con piccoli cristalli.

Il metodo è compatibile con il VMX della beamline di sincrotrone, ideale per un flex di fotoni elevato, un piccolo diametro del fascio e un rilevatore di ricarica veloce. In primo luogo, connettersi al sistema informativo esteso per il database della beamline di cristallografia proteica e scegliere MX.Log con il numero dell'esperimento e la password dal modulo A. Selezionare Quindi Spedizione Aggiungi nuovo e compilare le informazioni richieste.

Selezionare Aggiungi parziale e compilare i dati pertinenti. Selezionare Aggiungi contenitore, scegliere un disco SC3 e compilare le informazioni necessarie, incluse le posizioni dei supporti campione nel disco. Nell'hutch sperimentale, caricare il disco nel doer del cambio campione e notarne la posizione.

Successivamente, accedere al sistema informativo per il database della beamline di cristallografia proteica. Selezionate Prepara esperimento (Prepare Experiment), trovate la spedizione, selezionate Avanti (Next) e indicate la posizione della linea trave e del disco nel cambiacampo. Accedere al software di controllo beamline con il numero sperimentale e la password forniti nel modulo A.

Premere Sincronizza per sincronizzare il software di controllo della linea di fascio con il sistema informativo per il database della beamline di cristallografia proteica. Utilizzare il software di controllo della linea di fascio per montare il portacampioni sul goniometro. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse su una posizione nell'area del cambio di esempio e scegliere Campione montaggio.

Selezionare il pulsante centrale e quindi tre clic al centro al centro del bordo della punta del ciclo. Salvare la posizione centrata selezionando Salva. In Avanzate aggiungere il riorientamento visivo del flusso di lavoro alla coda di raccolta dati.

Quindi avviare il flusso di lavoro facendo clic su Raccogli coda. Selezionare quindi una delle posizioni del centro salvate facendo clic su di essa. Fare di nuovo clic sul pulsante centrale, quindi un centro di tre clic al centro dell'inizio dello stelo del ciclo.

Salvare la seconda posizione cliccando su Salva. E poi clicca su Continua. Dopo che il flusso di lavoro ha allineato il piano del portacampioni con l'asse di rotazione del goniometro, centrare nuovamente il portacampioni da qualche parte al centro della mesh.

Orientare il portacampioni in modo che la faccia della rete sia perpendicolare alla direzione del fascio di raggi X ruotando l'asse omega utilizzando il software di controllo della linea di fascio. Nel software di controllo della linea di fascio, fate clic sul menu a discesa Apertura (Aperture) e selezionate un valore. Quindi fai clic sull'icona dello strumento mesh per far emergere la finestra degli strumenti mesh.

Nella vista campione del software di controllo della linea di fascio, disegnare la mesh facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinando il mouse sull'area contenente cristalli sul supporto del campione. Per salvare la mesh, fare clic sul pulsante più nella finestra degli strumenti mesh. Nel campo di risoluzione del software di controllo della linea di fascio, immettere la risoluzione alla quale devono essere raccolte le immagini di diffrazione.

Se non sono note informazioni preliminari sulla qualità della diffrazione dei cristalli, si raccomanda un valore compreso tra due e 2,5. Selezionare MeshAndCollect nella scheda Raccolta dati avanzata. Aggiungerlo alla coda e fare clic su Raccogli coda.

Nella finestra dei parametri, utilizzate i parametri di default dipendenti dalla linea di fascio. Nell'esperimento qui descritto, i parametri predefiniti sono 0,037 secondi di esposizione per punto di scansione mesh, trasmissione al 100% e oscillazione di un grado per linea di scansione mesh. Fare clic su Continua.

La scansione mesh funziona e le immagini di diffrazione raccolte in ogni punto della griglia vengono analizzate e classificate in base alla forza di diffrazione con il software Dozer. Dopo l'analisi Dozer, viene generata una mappa termica e l'ordine per le successive raccolte parziali di dati viene assegnato automaticamente in base alla forza di diffrazione. Infine, fare clic su Continua per avviare le raccolte dati parziali.

MeshAndCollect implementato in MXCuBE è stato utilizzato per la raccolta di set di dati di diffrazione parziale da piccoli cristalli di Cerulean situati sullo stesso supporto del campione in cui l'identificazione visiva dei cristalli era difficile. Per schermare il portacampioni, è stata disegnata una griglia al centro del ciclo mesh e, in base alla mappa termica del punteggio Dozer, sono stati raccolti automaticamente 85 set di dati di diffrazione parziale. Questi sono stati integrati individualmente e poi uniti per produrre un set di dati con una completezza del 99,8% con una risoluzione di 1,7 angstrom.

Come previsto, la struttura cristallina del ceruleo potrebbe essere risolta con la sostituzione molecolare usando il set di dati generato. Dopo il perfezionamento, sono stati ottenuti un lavoro di R del 22,8% e una R priva del 25,4%. La super posizione della struttura determinata in precedenza mostra un RMSD globale su posizioni c-alfa di 0,1 angstrom.

Per i progetti in cui l'ottimizzazione della fase di crescita dei cristalli, MeshAndCollect offre la possibilità di ottenere un set di dati completo basato sulla combinazione di questi insiemi di dati parziali amorfo ottenuti da cristalli più piccoli. Questa tecnica ha spianato la strada ai biologi strutturali per risolvere una struttura dal campione di parti in cui non è stato possibile produrre solo pochi decimi di microcristamenti.