表面プラズモン共鳴(SPR)技術を用いた生体分子間の動的親和性のリアルタイム検出

Summary

本研究は、表面プラズモン共鳴(SPR)技術の原理と方法論を解明することを目的としており、これにより、複数のドメインにわたる多様な応用が見出されます。この記事では、SPR テクノロジ、その運用の容易さ、およびその優れた有効性について説明し、このテクノロジに対する読者の認識と採用を広く促進することを目的としています。

Abstract

表面プラズモン共鳴(SPR)技術は、ウイルス、病原性分子タンパク質、受容体の検出、血液型の決定、食品の不純物検出など、生体分子の検出を行うための高感度で精密な方法です。この技術により、生体分子間の潜在的な結合を迅速に特定することができ、標識を必要とせずに、さまざまな指標の迅速でユーザーフレンドリーな非侵襲的なスクリーニングが容易になります。さらに、SPRテクノロジーは、ハイスループットの薬物スクリーニングのためのリアルタイム検出を容易にします。このプログラムでは、SPR技術の応用分野と基本原理について簡単に紹介します。操作プロセスは、装置のキャリブレーションと基本的なシステム操作から始まり、リガンドの捕捉と分析物のマルチサイクル分析へと詳細に概説されています。ケルセチンとカリコシンのKCNJ2タンパク質への結合のリアルタイム曲線と実験結果について詳しく説明しました。全体として、SPRテクノロジーは、薬物スクリーニング、関連する薬物動態のリアルタイム検出、ウイルス検出、環境および食品安全性の同定のための、非常に特異的で、シンプルで、感度が高く、迅速な方法を提供します。

Introduction

表面プラズモン共鳴(SPR)技術は、分析物を標識する必要をなくす光学検出技術です。これにより、定量的な結合親和性、速度論、および熱力学のリアルタイムかつ動的なモニタリングが可能になります。このハイスループット容量は高感度で再現性が高いため、さまざまなオープンレート、オフレート、アフィニティの測定が可能です。さらに、必要なサンプル量が少ないため、この方法の有用性がさらに向上します^1,2。生体分子間の親和性結合をモニターする高速応答生体分子検出法³は、著名な研究分野として浮上しています。

SPR技術は、医薬品の研究開発の分野でさまざまな用途があります⁴。その用途の1つは、特定の薬物標的の構造的基盤を発見することです。また、有意な薬理活性を有する漢方薬の有効成分を特定し、薬物のスクリーニングと検証のためのそれらのメカニズムを研究するためにも使用できます。Gassnerらは、SPR測定により二重特異性抗体の線形用量反応曲線を確立し、これにより濃度分析と品質管理が可能になりました⁵。さらに、SPRは、薬局方やワクチン開発における臨床免疫原性試験の実施に利用できます⁶。

それが利用できる1つの領域は、農産物および食品安全性試験中の残留農薬、動物用医薬品残留物、違法添加物、病原菌、および重金属7,8,9,10の検出です。SPR技術を使用することで、これらのテストの精度と効率を向上させることができます。

SPR技術を適用できる別の分野は、毒素や抗生物質の迅速な検出です。この技術により、ウイルス抗体、低分子化合物、およびアプタマーをSPRバイオセンサーチップに付着させることができます。次に、SPRバイオセンサーチップは、分析物¹¹として異なる濃度のウイルスRNAを検出する。この方法は、H5N1、H7N9鳥インフルエンザウイルス、および新規コロナウイルス12,13,14などのウイルスの迅速な検出に成功裏に使用されています。これらのアプリケーションに加えて、SPR技術は、プロテオミクス、薬物スクリーニング、関連する薬物動態のリアルタイム検出、およびウイルスおよび病原性タンパク質および受容体の研究にも有用です15,16,17,18。特に大学や研究機関での科学研究や教育実験に適しており、さまざまな科学や研究の現場で貴重なツールです。

SPRの原理は、入射光波¹⁹によって引き起こされる、金属膜と誘電体との間の界面における自由電子の集団振動運動である。それは本質的に、エバネッセント波と金属表面²⁰上のプラズマ波との間の共鳴である。光が光密度の高い媒体から羞明的な媒体に移行すると、特定の条件下で全反射が発生します。波動光学の観点からは、入射光が界面に到達しても、すぐに反射光が発生するわけではありません。代わりに、最初に約1波長の深さで光学疎媒質を通過します。その後、界面に沿って約半波長流れた後、光学的に高密度の媒体に戻ります。光学疎水性媒体を通過するこの波は、光の総エネルギーが一定のままである限り、回避波と呼ばれます。金属は自由電子ガスを含んでいるため、プラズマとみなすことができます。入射光は電子ガスの縦方向の振動を励起し、金属と誘電体の界面に沿って表面プラズマ波として知られる電荷密度波を発生させます。この共鳴は、両方の媒体で指数関数的な減衰の形で伝播します。その結果、反射光のエネルギーが大幅に減少します。反射光が完全に消える対応する入射角は、共振角²¹として知られている。SPRは、金属膜表面²⁰に付着する媒体の屈折率に対して非常に敏感である。SPR角度は、金属フィルム表面の屈折率によって変化し、屈折率の変化は主に金属フィルム表面の分子量に比例する²²。表面媒体の特性や接着量が変化すると、共振角度が異なります。このように、共鳴角の変化を調べることで分子間相互作用を解析することができます。

上記の原理に基づくこの非破壊、ラベルフリー、リアルタイム光学SPR分析は、さまざまな分野の研究に適しています。そこで、ケルセチンとカリコシンとKCNJ2組換えタンパク質の組み合わせを例に、SPR曲線の角変位と実験結果をマルチサイクル解析により実証しました。

Protocol

注:完全な実験検出曲線は、実験プロセスを8つの異なる段階に分類できることを示しています。

1. サンプルとバッファーの調製

1. 実験前にセンサーチップを準備してください。
   1. チップをピラニア溶液(30%_H2O2:_H2SO4= 1:3; v / v)で2分間処理します。その後、チップを大量の脱イオン水で完全に洗浄し、無水エタノールに浸して自然乾燥させます。
   2. 次に、チップを50 Mの濃度の11-メルカプト-l-ウンデカノール(MUOH)の溶液に一晩浸し、その後、チップをエピクロロヒドリン溶液に入れ、25°Cで4時間反応させます。
   3. 溶液からチップを取り出し、蒸留水と無水エタノールで十分に洗浄します。最後に、デキストラン塩基性溶液をチップの金膜表面に滴下し、25°Cで20時間反応させます。チップを脱イオン水で洗浄し、ブロモ酢酸溶液に浸してデキストランヒドロキシルカルボキシメチル化修飾を実現します。ケルセチンとカリコシンをそれぞれ純度≥98.5%と≥99%で使用します。
2. ランニングバッファー、アクチベーター、固定化バッファー(10 mM 酢酸ナトリウム)、および再生液 10 mM Glycine-HCl、pH 1.5 を含むすべてのバッファーを調製します。この活性化剤には、115 mgのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、750 mgの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)、および10.5 mLの1 Mエタノールアミン塩酸塩-NaOHがpH 8.5で含まれています。各バイアルに10 mLのろ過済み脱イオン水を加えて、EDCとNHSを溶解します( 材料の表を参照)。
   注:EDCおよびNHSアリコートは-18°C以下で保存し、2か月以内にアリコートを使用してください。すべての溶液は使用前に脱気する必要があります。

2. 機器のキャリブレーション

1. 裸の金に異なる濃度(2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%の体積比)でアルコールを注入し、アルコールの最大ピーク値を比較すると、アルコール濃度とピーク値の標準曲線を描きます。
   注:50 μL/minの流速で注入すると、起源データ解析ソフトウェアにより標準曲線が得られました。
2. 技術マニュアルに従って、次の式を使用して、Kで表される機器の補正係数を計算します。
   K=Δθ/Δ[(A-B)/(A+B)]
   この式では、AとBはそれぞれの検出器の信号値を表します。マニュアルに示されているように、理論上の傾き値は0.06です。したがって、補正係数KはK=0.06/Rとして計算できます(ここで、Rは標準曲線から得られる線形回帰方程式の傾きです)。
3. 測定したΔ[(A-B)/(A+B)]の値に補正係数を掛けて、実際のΔθ値を求めます。

3. 基本的なシステム操作

1. システムを起動するには、電源スイッチをオンにし、検出ユニットが設定温度(通常は25°C)に達するまで待ちます。
2. [プログラムの開始]>>[OpenSPRTM制御ソフトウェア]をクリックして制御ソフトウェアを開くと、ソフトウェアプログラムは実行後にホストシステムに自動的に接続します。
3. SPR機器の標準操作手順に従って、COOHチップ(グルカンベースのチップ)を取り付けます。まず、SPRバイオチップの裏側に杉油を一滴垂らします。次に、COOHチップをセンサーのプリズム表面に取り付け、チップとプリズムの間に気泡がないことを確認します。最後に、フロープールを取り付け、光点に締めます。
   注意: フロープールを指定されたスロットに配置し、固定ネジを使用してしっかりと固定します。チャネルの寸法は10 mm x 1 mm x 1 mmです。
4. チップの配置
   1. 切りくずハッチを開くには、「ツール」(Tools) メニューの「切りくず挿入」(Insert Chip) オプションを選択します。チップベイにすでにチップがある場合は、[ツール]メニューの[チップの取り出し]オプションをクリックします。
   2. 新しいチップを使用する場合は、チップタイプのドロップダウンメニューから対応する チップタイプ を選択し、チップIDにチップに関連する実験情報を入力します。チップのロット番号を記入できます(オプション)。使用済みのチップの場合は、[ Reuse Chip ] を選択し、チップ ID ドロップダウンメニューで対応するチップ情報を見つけます。
   3. 単語側を上にしてチップを持ち、チップの矢印の方向に従ってチップをカードスロットにそっと押し込み、最後にチップコンパートメントのドアを閉じます。
   4. [Dock Chip](ドッキングチップ)ボタンをクリックします。チップが配置されると、システムは自動的にスタンバイ状態に切り替わります。
   5. 内部フローシステム全体を高流量でフラッシュするには、[ ツール]>[Prime]コマンドの[Start]>を選択します。全体のプロセスには6〜7分かかります。 「閉じる 」をクリックすると、システムが自動的にスタンバイ状態に切り替わります。
5. チューブホルダーの右側にある ブラックボタンを押し たまま、金属製のカバーを左側に開きます。適切な試験管を取り付けた後、金属製の蓋をそっと閉めます。カチッという音がする場合は、金属カバーがロックされています。
6. 試験管ホルダーをカードスロットに沿ってそっと押し込むampファイルコンパートメントに、試験管ホルダーが正しい位置にあり、ロックされていることを示すカチッという音が聞こえます。
7. 「イジェクト・ラック・トレイ」ダイアログ・ボックスで「OK」をクリックすると、ラックが自動的にサンプル・コンパートメントに供給され、ドアが閉じます。
   注:サンプルキャビンのドアが開くと時間制限があります。ドアは開いてから60秒後に自動的に閉じます。最後の15秒で、ダイアログボックスのカウントダウンが赤いフォントで表示され、点滅します。手を挟まないように、ドアが閉まるのを待ってから再度開きます。
8. 応答信号の正規化
   1. [ツール] > [その他のツール] を選択し、[メンテナンス ツール] ディレクトリで [正規化] を選択して、[開始] > [次へ] をクリックします。
   2. 120 μLの70% BIAnormalizing溶液を7 mm試験管に加えます。試験管をプログラムに示されている指定位置(R2F6)に置きます。チューブホルダーの蓋がきちんと閉まっていることを確認したら、チューブホルダーをサンプルコンパートメントに置き、キャビンのドアを閉め、[開始]をクリックしてプログラムを実行します。

4. リガンドの捕捉

1. pH測定
   1. リガンドをチップに固定する前に、適切なリガンドバッファーのpHをスクリーニングし、静電吸着によってチップの表面近くのリガンドを濃縮し、より良い結合効果を達成します。一般的なリガンド濃度は10〜100 μg/mLで、最初の実験では20 μg/mLを使用してみてください。
   2. pH値が5.5、5.0、4.5、および4の10 mM酢酸ナトリウムからリガンドをスクリーニングします。プロセスパラメータを設定するには、 Run-Wizard、Surface Preparation-Immobilization pH Scoutingを選択し、 Newをクリックします。
   3. チップチャンネルは、チャンネル1、2、3、4から選択できます。このバッファーには、10 mM 酢酸ナトリウム、pH 5.5、5.0、4.5、4 の 4 つのプリセット条件があります。次に、リガンド名、接触時間 (180 秒)、流速 (5 μL/分) を入力します。
   4. 表面を50 mM NaOHで再生した後、チップ表面温度とサンプルチャンバーの温度を設定します。次に、左側でサンプルと試薬ラック1を選択し、サンプルラック内の対応する位置に従って溶液を置きます。実験方法を保存し、[ 次へ] をクリックして実験を開始します。
2. リガンド固定化
   1. Run-Wizard、Surface Preparation-Immobilizationを選択し、Newをクリックします。モバイル化機能を FC1、FC2、FC3、FC4 の 4 つのチャネルに設定します。一般に、チャンネル 1 はチャンネル 1 と 2 をペアリングする際の基準として使用され、チャンネル 3 は 4 つのチャンネルすべてをモバイル化する際の基準として使用されます。
   2. ブランクコントラストまたは活性化閉鎖型リガンドフリーの固定には、リファレンスチャンネルを使用し、チャンネル1と2を使用してチャンネル2のリガンドを結合します。
      注:使用可能なカップリングモードには、固定レベルを目指すことと接触時間を指定することの2つがあります。固定化レベルモードを目指して、ターゲットカップリングレベルを入力すると、ソフトウェアは自動的に対応するレベルを達成します。接触時間モードは、注入時間と流量の入力が必要であり、一般的には事前実験に基づいて使用されます。

5. マルチサイクル分析物法

1. Primeを実行し、シリンジとチャンバーに固定バッファーを充填します。「Run」-「Manual run」を選択し、フローパス上の直列のチャネル 1-2 を選択して、「Start」をクリックします。
2. 最大流速(150 μL/分)で運転を開始し、HEPES(pH 7.4)であるバッファーを検出します。安定したベースラインに達したら、サンプルリングをバッファーでフラッシュし、サンプルリングを空にします。
   注:ベースライン(バッファーの実行時に検出曲線上に形成される平衡線)が10分以内に到達しない場合は、10 mMの水酸化ナトリウムを30秒間注入してみてください。
3. EDC/NHS(1:1、各50μL)溶液でチップを活性化します。
4. 活性バッファーで希釈したリガンド200 μLをサンプル上で4分間分析します。結合が安定したら、サンプルリングをバッファーで洗浄します。
5. ブロッキング溶液200μLをサンプルし、サンプルリングをバッファーですすぎ、空気で空にします。安定性を確保するために、ベースラインを5分間観察します。
6. 分析種を緩衝液で希釈し、3.9 μM、7.8 μM、15.625 μM、31.25 μMのケルセチン、15.625 μM、31.25 μM、15.625 μM、62.5 μM、125 μM、250 μMのカリコシンを20 μL/minでサンプルとして取ります。
7. タンパク質(10 μg/mL-50 μg/mL)とリガンドの結合時間は240秒で、自然解離時間は360秒です。流速を150 μL/minに増やし、適切な再生バッファーを注入して分析物を除去します。

6. 再生

1. 再生には、10 mM Glycine-HCl、高塩、またはさまざまなpHレベル(2.5、4.5、5.0、5.5など)の酸塩基溶液を使用してください。
2. 再生条件をスクリーニングするには、run-wizard-assay development-regeneration scouting を使用して [ 新規] をクリックします。流路上で直列に1〜2チャンネルを選択し、チップを選択して、[ 次へ]をクリックします。
3. チップをウォームアップするには、 スタートアップをクリックしますが、これは3倍以上行う必要があります。分析物の名前を入力し、再生溶液の流速を150 μL/minに設定します。

7. データ分析

1. SPRデータ解析ソフトウェアで、One to One解析モデルを使用して実験結果を解析します。
   注:プロセス全体は、実行中のバッファで実行されます。SPRアッセイプロセスで使用される他のバッファーは、注入バッファーと同じです。

8. システムメンテナンス

1. 実験終了後、検出チップを取り外し、メンテナンスチップと交換します。ランニングバッファーを十分な新鮮な純水と交換し、システムをプライムで洗い流します。プライミングが完了すると、システムは自動的にスタンバイモードに切り替わり、廃液ボトルを清掃し、針の水を交換します。

Results

タンパク質がチップ表面に固定されているかどうかを判断するために、SPRセンサーマップ(図1)の縦座標(応答信号)を使用し、SPR曲線の角変位を求めます。 図2 および 図3 は、3.9 μMから250 μMの範囲の濃度で制御還元した後の、KCNJ2組換えタンパク質の固定化表面上のケルセチンおよびカリコシンとKCNJ2組換えタンパク質との相互作用のSPR曲線を示しています。物質輸送の影響による不正確さを最小限に抑えるために、KCNJ2組換えタンパク質分子は低濃度で固定されただけでなく、速度論試験中に20μL/minの高流速にもさらされました。その結果、ケルセチンとカリコシンの用量反応官能マップが得られました。 表1 と 表2 は、運動速度定数(会合速度定数Ka;解離速度定数Kd)と解離平衡定数(KD)の計算結果を示しています。両者を比較すると、カリコシンのKa定数はケルセチンのKa定数よりも高い...

Discussion

SPR解析サイクルは4つの段階に分かれています。最初の段階であるベースラインには、バッファーの注入が含まれます。それに続くのが第2段階であるリガンド捕捉です。センサーチップCOOHは、EDC/NHS(1:1)で20μL/minの流量で活性化されます。次に、チップを1 Mエタノールアミン塩酸塩-NaOHを使用して、20 μL/minの流速で不活性化します。次に、第3段階であるマルチサイクル分析種法に進みます。分析種は、20 μL/minの流速で240 sの会合相でチャネルに注入され、続いて360 sの解離期間が続きます。関連付けプロセスと分離プロセスの両方が、実行中のバッファーで実行されます。分析種のサイクルは、分析種の濃度に応じて昇順で繰り返されます。相互作用解析の各サイクルの後、10 mM グリシン-HClを注入バッファーとして使用して、150 μL/minの流速でセンサーチップの表面を完全に再生し、分析対象物を除去する必要があります。次に、分析物の注入と再生ステップを行うことにより、分析物の次の濃縮サイクルが繰り返されます。最後に、第4ステップでは、10 mMグリシ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)	Nan Jing Reagent,Nanjing,China	C08296594
無水エタノール	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	459836
BIAnormalizing solution	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	49781
ブロッキングソリューション	Bosheng Biotechnology Co.,Ltd.,上海、中国	110050
ブロモ酢酸	Merck Chemical Technologies Ltd.、上海、中国	17000
Calycosin	Push Bio-technology Co., Ltd.、成都、中国	PU0124-0025
Dextran	Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.、上海、中国	PM10036
Epichlorohydrin	Merck Chemical Technologies Ltd.、上海、中国
エタノールアミン塩酸塩	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S44235
Glycine-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	3587191
H2SO4	Nantong high-tech Industrial Development Zone,China	2020001150C
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCNJ2 (Human) Recombinant Protein	Abnova,West Meijie Technology Co., Ltd., Beijing, China	H00003759-Q01
MUOH	Jizhi Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	SX0603
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)	Yuanye Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
Quercetin	Push Bio-technology Co., Ltd., Chengdu, China	PU0041-0025
Sensor Chip COOH	Nicoya
Sodium Acetate	Merck Chemical Technologies Ltd., Shanghai, China	229873