自己組織化組換えタイプIコラーゲン線維におけるコラーゲン鉱化のための多色3D-STORM高解像度可視化プロトコル

Summary

ここでは、多色3D-STORMを用いて組換えコラーゲン線維における線維内石灰化と線外石灰化を区別するプロトコルを提示し、最適化された標識、画像診断、定量的共局在解析を統合します。

Abstract

本プロトコルは、組換えタイプIコラーゲン自己組織化線維モデルにおけるコラーゲン鉱化のナノスケール可視化のための多色三次元確率光学再構築顕微鏡(3D-STORM)手法を記述します。この手法により、コラーゲン、非コラーゲンタンパク質(例:コンドロイチン硫酸)、およびリン酸カルシウム鉱物相の同時イメージングが可能です。サンプル調製はアミノシラン化とコラーゲンの自己組織化を含み、その後、リン酸カルシウム培地を用いた鉱化処理が行われます。この培地は早期段階(30分)に非晶質のリン酸カルシウム(ACP)を生成し、6時間でヒドロキシアパタイト(HAP)に成熟します。その後、多重免疫蛍光標識が行われ、まずコフォーカル顕微鏡でサンプルを評価し、その後酸素除去イメージングバッファを用いた3D-STORM画像取得を行います。データ処理と分析は公開されているソフトウェアを用いて行われます。従来の電子顕微鏡や共焦点顕微鏡と比較して、このプロトコルは分子特異性とナノスケールの解像度(典型的な横方向精度20–30 nm、軸方向50–60 nm)を組み合わせており、線維内および線維外の鉱化パターンを三次元で可視化することが可能です。代表的な結果は、三次元空間内でコラーゲンネットワーク、関連する非コラーゲンタンパク質、鉱物相の明確な可視化を示しています。結果セクションには、ピアソン相関係数(0.89 ± 0.04)やマンダースの重複係数(0.91 ± 0.03)などの定量的指標が提供されています。このプロトコルは、バイオマテリアルサイエンス、バイオミネラリゼーション、骨組織工学の研究者にとって、鉱化ダイナミクスに関するナノスケールの洞察を必要とする強力なツールを提供します。

Introduction

コラーゲンの石灰化は、骨や歯などの硬組織形成において重要な基本的な生物学的プロセスです^。コラーゲン繊維の複雑な構造と、鉱物沈着の精密な調整が相まって、これらの組織に驚くべき機械的強度と構造的完全性をもたらしています².コラーゲンは単なる受動的な足場ではなく、複雑な分子および物理的相互作用を通じて正確な鉱物沈着を指揮する積極的な参加者として機能します^。これらのメカニズムを解明することは、骨粗鬆症やうなすなどの病理的状態の理解や、再生療法のための生体模倣材料の開発に^{不可欠です。}

硬組織中のコラーゲン線維の直径は約50から100 nmの範囲で、ヒドロキシアパタイト(HAP)粒子はさらに小さく(通常厚さ2–5 nm、長さ20–30 nm)、線維の隙間内に挟まれています⁵。ギャップゾーンは核生成部位として機能しますが、原生組織では鉱物は最初線維間空間で形成され、その後線維内区画へと拡大します。従来の特徴付け方法には、組織学的染色、共焦点レーザー走査顕微鏡^6,7、電子顕微鏡^8,9が含まれます。組織学的染色はマクロ的な評価を提供しますが、ナノスケールの鉱化状態は評価できません。共焦点顕微鏡は特定の成分の観察が可能ですが、回折制限(横方向~200 nm)があり、線維内と外線維化の鉱化を区別^{できません。}電子顕微鏡は高解像度を提供しますが、分子特異性に欠けます。免疫金標識は電子顕微鏡における分子特異性を提供しますが、専門的な処理が必要であり、STORMと比べて複数成分の多重化・三次元可視化には適さにくく、実験サイクルが長く^{高コストとなります}。

確率的光学再構成顕微鏡(STORM)は、個々の蛍光素を高精度で局在させることで回折限界を克服し、約20 nmの横方向分解能¹²を達成します。誘導放出除去(STED^)顕微鏡や構造化照明顕微鏡(SIM)¹⁴など他の超分解能技術と比較して、STORMはより高い局在精度(横方向~20 nm、軸方向~50 nm)を提供し、より幅広い有機蛍光分子と互換性があります。特に、STEDは特殊な染料と高出力のレーザーを必要とし、生物サンプルを損傷させる可能性があります。一方、SIMは約100 nmの解像度しか提供できず、繊維スケール(50〜100 nm)の特徴を解消するには不十分です。STORMは解像度、多重化能力、サンプル互換性の実用的なバランスを提供します。公開されたガイドラインでは、STORMイメージングパラメータの最適化と解像度評価を促進するための標準化された試験サンプルについて説明^{されています。}三次元イメージング機能と組み合わせることで、3D-STORMは複数のコンポーネントを同時にナノスケールで可視化すること^{を可能にします。}近年の進歩により、STORMは多色および多重化イメージングに拡張され、同一サンプル^内の複数の標的を可視化^{できるようになりました。}

このプロトコルは、自己組織化組立型I型コラーゲン線維に基づく生体模倣型in vitroモデルを用い、ナノスケールで線維内組換え型1型コラーゲン自己組織化線維モデル向けに明示的に設計されています。STORMは固定サンプルと酸素除去バッファーを必要とするため、ライブセルイメージングには適していません。また、先に脱灰化や抗原回収なしに、成熟した骨など、自然の高鉱化組織には適していません。全体の鉱物密度や大面積の形態のみを評価する必要がある場合は、従来の共焦点顕微鏡や電子顕微鏡の方が効率的です。

このプロトコルの全体的な目標は、多色3D-STORMを用いて個々のコラーゲン線維内のミネラルおよび非コラーゲンタンパク質のナノスケール分布を可視化するための標準化された段階的なワークフローを提供することであり、特に線維内鉱化と線維外の鉱化を区別することに重点を置いています。このプロトコルは最適化された免疫標識とカスタマイズされたイメージングバッファを統合し、複数の有機成分(コラーゲン、非コラーゲンタンパク質)および無機相(ACP、HAP)を3次元で同時に追跡できるようにします¹⁹。重要な革新は、線維内と線維外の鉱化パターンの定量的評価です。定量化は2つの独立した基準によって達成されます。(1) 画像解析ソフトウェアの共局在モジュールを用いて、鉱物(カルシウム指示色素(例:カルセイン))とコラーゲン(遠赤色蛍光染料)チャネル間のピアソン共局在係数を計算すること(係数>0.8は強い関連を示します);(2) 個々の線維のZスライス全体における鉱物信号の持続性の解析:鉱物信号が中心スライス(線維の垂直中心からZ=0から±120 nm)に最大強度≥の50%で存在する場合、それは線維内信号に分類されます。従来の電子顕微鏡や共焦点顕微鏡とは異なり、このプロトコルは分子特異性とナノスケールの分解能を組み合わせ、線維内鉱化の三次元空間分布を可能にします。

このプロトコルは、バイオ材料科学、バイオミネラル化、骨組織工学の研究者向けに設計されており、鉱化ダイナミクスのナノスケールの洞察が必要です。標準化手順は、脱灰象牙質スライスやコラーゲンベースのハイドロゲルなど、他の鉱化コラーゲン系の研究にも応用でき、初期のサンプル準備工程を調整することで可能です。

Protocol

生物学的サンプルを含むすべての実験は、浙江大学医学院コア施設のガイドラインと規則に従って実施され、機関バイオセーフティ委員会(承認証明書番号)によって承認されました。BSL20235710079)。ここで述べる実験プロトコルは、市販の試薬およびin vitro生体模倣システムを利用しています。この試験は人間の参加者、動物被験者、またはヒト組織サンプルを含まないため、機関審査委員会の倫理的承認を必要としません。

注意:有害化学物質を扱うすべての処置は、適切な個人用防護具(白衣、手袋、安全ゴーグル)を着用したフムフード内で行う必要があります。化学廃棄物は機関の規則に従って処分してください。NaN₃の場合は「アジド廃棄物」と記された専用容器に廃棄物を回収し、酸と混ざる(爆発ガスのリスクがあるため)してください。グルターアルデヒドの場合は、処分前に10%余量の亜硫酸ナトリウムを不活化してください。βメルカプトエタノールの場合は、ドレイン廃棄前に漂白剤(1:10 v/v)で1時間酸化してください。

注意:免疫蛍光標識は鉱物化の前に行う必要があり、鉱物堆積物によるエピトープマスキングを防ぐ必要があります。鉱化後標識が必要な用途では、抗原回収が必要となる場合があります。

1. 鉱化媒体の調製

1. 再構成されたコラーゲン線維のための鉱化培地の調製
   1. カルシウムストック溶液を、15 mLの円錐形チューブ内に5 mLのポリアスパルト酸(p-Asp、Mw 9-11 kDa)を滴下に加え、3.44 mM CaCl₂溶液5 mLに加えて準備します。
   2. チューブ内で30秒間ボルテックスミックスを行い、均質になるまで続けます。
   3. p-Aspをゆっくり加え、十分に混ぜて非晶質リン酸カルシウム(ACP)を安定化させます。
   4. カルシウムストック溶液にリン酸塩溶液5mL(19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl)を加えます。
   5. 1分間、ボルテックスミックス。
      注:混合後の最終濃度:1.67 mM CaCl₂、9.5 mM Na₂HPO₄、150 mM NaCl、50 μg/mL p-Asp。
   6. 使用直前に鉱化培地を準備してください。保管しないでください;不安定なACP前驅体を即座に使用し、一貫した結果を得る。
      注:保管は早期結晶化を引き起こします。
2. コラーゲンゲル/脱灰象牙質用のミネル化培地の調製
   1. カルシウム含有溶液を800 mLの脱イオン水に溶かして、8.77 g NaCl、0.01 g NaN₃、6.06 g Tris、1.11g CaCl₂を準備します。
   2. 脱イオン水で1リットルまで下げます。
   3. カルシウム含有溶液に350 μg/mLのポリアクリル酸(PAA、Mw ~1800)を加えます。
   4. 1分間の渦巻き。
      注意:高カルシウム濃度では安定化のためにp-Aspの代わりにPAAを使用してください。
   5. リン酸塩溶液を1リットルの脱イオン水に0.85 g Na₂HPO₄を溶解して6 mM Na₂HPO₄を得ます。
   6. 0.22μmの膜を使ってリン酸塩溶液をろ過滅菌します。
   7. カルシウムとリン酸塩の溶液をそれぞれ500mLずつ同じ体積で300rpmで磁気攪拌します。
   8. pHメーターでモニタリングしながら、1 M HClまたはNaOHを使ってpHを7.4に調整してください。
      注意:pHは7.4±0.1に保ってください。pHの偏差>0.2は早期結晶化を引き起こすため避けてください。

2. 組換えコラーゲン線維の製剤

1. ガラス底皿のアミノシラン化
   注:この処理は(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)を用いて、ガラス表面に正に帯電したアミノ基(-NH₂)を導入し、負に帯電したコラーゲンモノマーの静電吸着と安定化を促進します。
   1. 各ガラス底培養皿(35mm、#1.5H厚さ、0.17mm±0.005mm)に200μLのAPTES溶液(絶対エタノール中の5% v/v)を加えます。
   2. APTES溶液で皿の表面を完全に覆いましょう。
   3. 室温(20〜25°C)で暗闇で2時間孵化します。
   4. 絶対エタノール(1回の洗濯で2mL)で皿を3回すすいでください。
   5. 脱イオン水で40kHzで10分間超音波処理を行います。非特異的な結合を防ぐために残留APTESを完全に除去してください。
   6. シラン化された料理は4°Cの乾燥保存で最大1週間保存可能です。
   7. (任意)安定性を高めるために焼く:洗った料理と乾燥した料理を100〜120°Cのオーブンで30〜60分加熱します。
   8. 作業前に室温まで冷やしてください。
      注意:プラスチック製の皿を使用する場合は、変形を防ぐために温度を80°C以下に下げてください。BitterとMuirのシラン化手順を適応させ^{てください。}
2. コラーゲン自己組織化と架橋
   1. 各シラン化皿に100μLのコラーゲンI溶液(50μg/mL、0.1 M酢酸)をピペットで注ぎます。
   2. 湿度室(相対湿度90%>)で37°Cで10時間孵化します。溶液の蒸発を防ぐために湿度を安定させてください。
   3. 位相差顕微鏡や共焦点顕微鏡で線維形成を確認すること;成功した調製は細かくウェブのような繊維網を示します。
   4. 超微構造レベルで適切な繊維形成を確認するために、同じ自己組織化条件(コラーゲンI50μg/mL、37°C、>湿度90%)でポリビニルフォーマル/カーボンコーティングされたTEMグリッド上で別個の試料を準備します。
   5. 1%のリン酸(pH 7.0)で10分間染めます。
   6. 脱イオン水で洗いましょう。
   7. 透過式電子顕微鏡で観察してください。線維形成が成功していることは、特徴的な67 nmのD周期帯状パターンによって示されています(図3参照)。
   8. ガラス底の皿から残留コラーゲン溶液を慎重に吸引します。
   9. 各皿に2mLのコンドロイチン硫酸塩(CS)溶液(PBSで50 mg/mL、pH 5.5)を加えます。
   10. 4°Cで12時間インキュベートし、CSがコラーゲン線維に静電気吸着できるようにします。
   11. EDC/NHS架橋溶液²¹を準備します:0.2MのEDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)と0.05MのNHS(N-ヒドロキシスクシンニミド)をMESバッファー(0.1 M MES、pH 5.5)に溶解させます。
       注:MESバッファーは、MES遊離酸を脱イオン水に溶かし、NaOHでpHを5.5に調整することで調製できます。
   12. CS溶液を除去し、EDC/NHS架橋液を2mL加えます。
   13. 室温で2時間培養し、コラーゲン上のCSを共有結合固定します。
   14. 未反応試薬を除去するためにPBSで皿を3回洗い(各5mL、各5分)します。
   15. 加工済みコラーゲン繊維はPBSで4°Cの温度で最大24時間保存し、その後鉱化します。

3. 免疫蛍光標識(石化前に実施)

1. 試料の調製
   1. コラーゲン線維は500 mM NaCl溶液(1回10 mL、各5分)で3回洗い流します。
   2. 脱イオン水で3回洗います(1回10mL、1回5分)。
   3. 50回転/分の水平シェーカープラットフォーム上で洗浄を行い、組み立てられた繊維を剥がす可能性のあるせん断力を最小限に抑えつ徹底的な洗浄を行います。
2. ブロッキングと一次抗体培養
   1. ブロッキングバッファー(5%牛血清アルブミンをPBSで使用)を用いて37°Cで加湿チャンバーで1時間培養します。
   2. ブロッキングバッファーに抗体カクテルを準備します:ウサギ抗コラーゲンI(1:100希釈)とマウス抗コンドロイチン硫酸(1:100希釈)。
   3. 1サンプルあたり200μLの抗体カクテルを追加します。
   4. サンプルを実験室用のシールフィルムで覆う。
   5. 4°Cで一晩(12〜16時間)抱卵します。
   6. アルミホイルを使って光から守りましょう。一次抗体培養後、サンプルはPBSで4°Cの温度で最大24時間保存可能です。
3. 二次抗体染色
   1. 未結合の一次抗体は、洗濯バッファー(0.1% Tween-20 in PBS)で3回、各10分洗うことで除去します。
   2. 蛍光セカンダバチ混合物をブロッキングバッファー(35mm皿あたり200μL)で準備します。その中には、遠赤色蛍光色素(1:100)にヤギ抗ウサギ用IgGを接合させ(1:100)、ヤギ抗マウス用IgMを赤色蛍光染料に接合させ(1:100)を含みます。
      注意:この段階以降は、蛍光色体の光漂白を防ぐために試料を光から守ってください。
   3. サンプルを室温(20〜25°C)で暗闇で1時間培養します。
   4. 洗浄バッファーで3回(各10分)洗い、結合していない二次抗体を除去します。
      注意:画像検査前に、4°C(光保護)で最大48時間保存してください。自己蛍光の検査のために一次抗体なし対照群を含めてください。

4. コラーゲン繊維の石灰化(標識後に実施)

1. 鉱化過程
   1. 各皿につき、新たに準備したミネラリゼーション培地2mLを加えます。
   2. 初期鉱物(ACP)形成のために37°Cで30分間(短期)培養します。
   3. または、成熟鉱物(HAP)結晶化のために37°Cで6時間(長期)培養します。
      注意:校正済みインキュベーターを使用して、正確な温度を37°C±0.5°Cに保ってください。
   4. 鉱化培地を軽く吸引します。
   5. 脱イオン水で3回(洗車1回5mL、間隔1分)ですすぎます。
2. リン酸カルシウム標識
   1. PBSにカルシウム指示色素(例:カルセイン)を4 μM(1皿あたり200 μL)添加します。
   2. 室温(20〜25°C)で暗闇で30分間孵卵します。
      注意:カルシウム指示色素(例:カルセイン)はカルシウムイオンに結合し、非晶質相と結晶相を区別できません。相の割り当ては鉱化時間(30分=ACP、6時間=HAP)に基づいています。琥珀色のチューブやホイルラップで光から保護するべきです。
   3. すすぎは5回行います:脱イオン水で3回洗い、70%エタノールで2回(各1分)交互に洗います。
3. 画像診断のためのサンプル準備
   1. 画像バッファーにサンプルを浸けてください:PBS中に10%(w/v)グリセロール。メーカーの指示に従って、必要に応じてアンチフェード試薬を追加してください。
   2. サンプルを覆うのに十分な量(20〜50μL)のイメージングバッファーを適用します。
   3. サンプルの上にカバースリップをかぶせます。
   4. サンプルは暗闇で4°Cで最大72時間保存します。

5. レーザー共焦点顕微鏡による観察

1. 4°Cの貯蔵から室温(20〜25°C)へのサンプル移送。
2. 結露を防ぐために10分間の平衡を設けてください。
3. 琥珀色の容器やホイルラップを使って軽い保護を保ちましょう。
4. イメージングバッファーがサンプル全体をカバーしているか確認してください。
5. 共焦点顕微鏡を以下の設定で設定します:
   1. コラーゲンイメージング(遠赤色蛍光染料):647nmレーザー、発光フィルター650〜710nm。
   2. リン酸カルシウムイメージング(カルシウム指示染料(例:カルセイン)):488 nmレーザー、発光フィルター500-550 nm。
   3. 目的:100×の油浸し(NA 1.4)。
   4. ピンホール直径:1エアリー単位(AU)。
   5. ピクセル滞留時間:1〜2μs。
      注意: 画像撮影前にレーザーアライメントとピンホールキャリブレーションを行ってください。
6. 逐次走査を行う:647 nm励起(コラーゲン)での最初のスキャン。
7. 488nm励起(鉱物)で2回目のスキャンを行います。
   注意:ブリードスルーを避けるためにチャネルは順番に収集してください。
8. 3D再構成では、十分なサンプリングを確保するためにZスタックのステップサイズを0.5μm以下に設定してください。
9. メタデータを保持したセーブファイル。
10. 共局在化解析では、ピアソン相関係数を計算できる画像解析ソフトウェア(例:適切なプラグインを備えた公開ソフトウェア)を使用してください。

6. 三次元確率光学再構成顕微鏡(3D-STORM)によるイメージング

1. STORMイメージングバッファ²²の準備
   注:グルコース酸化酵素とカタラーゼは、酸素を回収するためにイメージングバッファーに加えられ、これにより光漂白を減らし、STORMにおける単一分子局在に不可欠な蛍光分子の点滅を延ばします。
   1. グルコース酸化酵素(GOx)ストック溶液を8 mg/mLで、50 mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH 5.1)に調製します。
   2. 160 μg/mL、1× PBSでカタラーゼストック溶液を準備します。
      注意:酵素ストックをアリコット(分割)し、液体窒素またはドライアイス/エタノール浴で速凍し、-20°Cまたは-80°Cで保存してください。 繰り返される凍結融解のサイクルは避けてください。
   3. 光から保護された氷の上に新しいSTORMイメージングバッファを準備してください。
   4. 最終体積1 mLまでの順序で以下の成分を組み合わせます:滅菌ヌクレアーゼフリーH₂O(1 mLまで)、1 M NaCl(10 μL、10 mM最終)、1 M Tris-HCl pH 8.0(50 μL、50 mM 最終値)、pH ~7.0に調整した新鮮な1 M システィミン(MEA)(50 μL、50 mM最終値)、50%(w/v)グルコース(200 μL, 最終液10%、GOxストック(200 μL、1.6 mg/mL)、カタラーゼストック(200 μL、32 μg/mL)。
   5. ピペッティングや逆さまで優しく混ぜます。渦を巻くな。
      注意:バッファーは新鮮な状態で準備し、光から守られた氷の上に保管する必要があります。調理から30分以内に使用してください。STORMイメージング条件の詳細な最適化については、試験サンプル¹⁵を用いた確立されたプロトコルを参照してください。
   6. 新たに調製したSTORMイメージングバッファー200μLを加え、サンプルを完全に覆います。
2. 3D-STORMシステム構成
   1. イメージング経路が電子増幅CCD(EMCCD)カメラに向けられていることを確認してください。
   2. 3Dイメージングのために円筒形レンズモジュールを起動してください。
   3. ソフトウェアを3D STORM取得モードに設定してください。
   4. 使用する染料に対して光経路フィルターを設定してください。
   5. 647 nmレーザーを起動し、出力を低レベル(1〜5 mW)に設定します。
   6. 100×油浸水用対景(NA ≥1.4)を用いて、ワイドフィールドまたはTIRFライブプレビューモードで関心領域を特定します。
   7. 後で比較するために従来の広視野蛍光画像を取得してください。
   8. TIRF照明モードに切り替えてください。
   9. TIRF角度を校正して薄い照明場(~100〜200 nm)にし、背景蛍光を最小化します。
   10. 初期の信号強度に基づいてカメラの露光時間(10〜30ms)を調整します。
   11. 初期信号強度に基づいてイメージングレーザーの出力を調整します。
   12. 簡単なテスト取得を行います。
   13. パラメータが正しく設定されているか、急速な光漂白を引き起こしないか確認してください。
       注意:円筒レンズ軸と試料面の正確な整列を確認してください。ほとんどの現代システムは自動キャリブレーションを備えています。手動校正では、対称的な円点拡散関数(PSF)を検証するために100 nm蛍光ビーズを使用します。
   14. まずは10〜30msの露光から始まり、647 nmのレーザー出力(1–2 kW/cm^²)で行われます。
   15. 点滅密度が0.1–1分子/μm^²であることを確認しましょう。
   16. 密度が低すぎたり高すぎたりする場合は、レーザーの出力や露光時間をそれに応じて調整してください。
   17. 理想的な密度が得られるまで検証と調整を繰り返します。
3. 3D-STORMデータ取得
   1. 取得ソフトウェアを「継続的アクティベーション」モードに設定してください。
   2. イメージングレーザー(647 nm)を高出力(100-500 mWのファイバー入力)に設定し、ほとんどの蛍光色素をダーク状態に遷移させます。
   3. 起動レーザー(405nm)を低出力(0.1〜5 mW)に設定してください。
   4. 405 nmの出力を経験的に最適化し、256×256ピクセル領域内で1フレームあたり100〜200個の局在分子を維持します。
   5. 合計フレーム数を10,000〜20,000に設定します。
   6. 1サイクルごとに活性化光(405nm)を1フレーム、続いてイメージングライトを5フレーム(647nm)使用します。
   7. 取得を始めましょう。
   8. EMCCDを最大感度で操作(EM利得適用)
   9. 1フレームあたり10〜30msの露出を使いましょう。
   10. 取得時には、活性分子密度を監視してください。
   11. 405 nmのレーザー出力を調整し、単一分子イベントの一定の流れを維持します。
       注意:生の映画データは、再構築前の長期アーカイブのために標準的なハードドライブに保存できます。
4. コラーゲン鉱化のデータ解析(STORMモジュールを用いた画像解析ソフトウェアを使用)
   1. 解析ソフトウェアで適切なカメラドライバー(STORMモジュール)を選択してください。
   2. STORMパネルの [Analysis GUI] をクリックしてください。分析ウィンドウが開く。
   3. [ファイルを開く]をクリックします。解析対象の生顕微鏡画像ファイルを選択します。「開く」をクリックします。
   4. 有効な信号の最小蛍光値(最小高さ)を決定します。
   5. 単一分子の信号としてまだ認識できる最も暗い部分を見つけてください。
   6. マウスを中心に動かします。
   7. ピーク・ハイトの値を読みましょう。
   8. この値を記録してください。
   9. [識別設定]をクリックしてください。ダイアログで以下のパラメータを設定します:最小高さ(ステップ6.4.8で記録された値を入力)、最大高さ(20000)、CCDベースライン(100)、そして3D-STORMデータについては「3D」チェック(2Dの場合はチェックを外す)。
   10. >>をクリックすると、さらに多くのパラメータを展開できます。設定:最小幅(nm)を200に、最大幅(nm)を700(2Dは400)、初期フィット幅(nm)を300に、最大軸比を2.5(2Dは1.3)、最大変位(ピクセル)を1に。
   11. 「OK」をクリックしてダイアログを閉じます。
   12. パラメータを検証するためにテスト解析を行います。ドリフト補正のチェックを外してください。
   13. ピリオドを1に設定します。
   14. [テスト]をクリックします。
   15. 分析後、ポップアップのダイアログで「OK」をクリックします。
   16. 信号スポットが正しく識別されているか確認してください。バックグラウンドノイズは誤選してはいけません。本当のスポットを見逃してはいけません。
   17. 満足できない場合は、パラメータを修正するためにステップ6.4.9–6.4.16を繰り返し、正しいものまで調整します。
   18. テスト解析が完了したら、完全な解析を行います。ドリフト補正をチェックしてください。
       注:解析ソフトウェアは、分子局在の時間区分間の相関を最大化する冗長な交相関(RCC)アルゴリズムを用いてドリフト補正を行います。フィデューチャルビーズは必要ありません²³。
   19. 保持期間=1。
   20. [スタート]をクリック(または再度[テスト]をクリックし、その後[スタート])。
   21. 分析が終わるまで待ちましょう。ポップアップダイアログでOKをクリックしてください。
   22. 分析後、.nd2ファイルと同じフォルダ内に2つの結果ファイル(.binと.txt)が生成されます。
   23. 共局在解析(647nmおよび488nmチャネル)では、解析ウィンドウのチャンネルリストに両チャネルを同時に表示します。
   24. 適切な関心分野(ROI)を選択してください。
   25. 共局在モジュールを使ってピアソン相関係数を計算してください。自動で提供されていない場合は、公開されている画像解析ソフトウェア内の共位置化プラグインにポイントクラウドデータを手動でエクスポートしてください。価値を記録してください。
   26. 線維内鉱化を確認するためにZスライス分析を行う。メインメニューで「Zステップ>スライス>表示」を選択します。
   27. 60 nm間隔で個々の平面を抽出します。
   28. 鉱物信号(緑、488nmチャネル)を観察してください。信号が中央スライス(Z = 0 nm±120 nm)に残っているか確認してください。持続性により線維内鉱化が確認されます。
   29. オプション:密度フィルタリングを行い、密充填エミッターからの過剰カウントを減らします。STORMの再構成画像を、単一分子局^{在解析用の}プラグインを使って公開されている画像解析ソフトウェアで開いてください。
   30. 密に詰められたエミッターからの過剰計測を減らすために、信号密度に基づく密度フィルタリング(例:中央値フィルタや局所密度閾値)を適用します。
   31. ステップ6.4.18でドリフト補正が有効でなかった場合や追加の補正が必要な場合は、ドリフト補正を実行します。これは受託者標識のPSFに基づいて正しいです。あるいは、同じプラグインで実装されたドリフト補正などの相互相関アルゴリズムを用いることができます。
   32. チャネルクロストークを除去するためにスペクトルアンミックスを行います。STORM解析ウィンドウで、クロストーク除去ツール(通常右下)をクリックします。
   33. 半径を25.0nmに設定してください(推奨)。ソースチャンネルを選択してください。除去方法を選択してください:統計的除去が推奨されます。
   34. 励起レーザーによる交差活性化を除去するには、交差活性化に加えて「減算」を選択してください。> 交差活性化です。OKをクリックしてください。新しいチャネル「Nonspecific Activation-Xt」が自動的に生成されます。
   35. 染色されていない対照試料を用いて自己蛍光レベルと背景信号を検証する。すべての信号に明確にラベルを付けてください。
   36. 3Dビジュアライゼーションを実行してください。分析ウィンドウで関心領域(ROI)を選択します。
   37. [3D]ボタン(または[3D表示])をクリックしてください。3D投影やボリュームレンダリングを生成します。
   38. 右クリックでレンダリングパラメータを調整してください。一般的なフォーマット(例:.aviや.mp4)で動画をエクスポートしてください。
   39. 鉱物信号を線維内信号として分類するには、6.4.26–6.4.28のようにZスライス解析を行います。強度プロファイルをエクスポートしてください。
   40. 線維中心を、コラーゲン信号が最大になるZ平面と定義します。
   41. 鉱物信号が、Z = 0(中心)およびZ = ±60 nmでの強度がその線維内の最大鉱物強度の≥50%である場合、その線維内信号とみなされます。Z = 0で信号が30%を下回る場合は、線維外と分類されます。
   42. 各条件で少なくとも50本の繊維の分類を記録し、線維内鉱化率を算出します。
       注意:密度フィルタリング、ドリフト補正、スペクトルアンミックス用の代替公開プラグインも利用可能です。

Results

このプロトコルの成功裏の実装により、多色3D-STORMを用いて鉱化コラーゲン線維の高解像度三次元可視化が可能となります。以下の結果は、典型的な結果、品質管理、定量的評価を示しています。

図1 は、非晶質リン酸カルシウム(ACP)で鉱化されたコラーゲンネットワークの多色3D-STORM再構築を示しています。コラーゲン(遠赤色蛍光染料で標識されたもの)は明確に定義された線維状ネットワークとして現れます。コンドロイチン硫酸塩(GAG、赤色染料で標識)はコラーゲン線維と密接に関連しており、結合画像では共局所領域がシアン色に見えます。重要なのは、ACP粒子(緑色でカルシウム指示色素で標識)がコラーゲン線維の境界内で観察され、初期段階(30分)で線維内石化が示されていることです。この図は、従来の共焦点顕微鏡では達成できない、コラーゲン、GAG、ミネラルという3つの異なる成分をナノスケールで同時に分離できるプロトコルの能力を示しています(画像解像度の比較は

Discussion

このプロトコルは、多色3D-STORMを用いたコラーゲン鉱化のナノスケール可視化のための包括的なワークフローを提供します。成功を確実にするためには、特に注意が必要な重要なステップがいくつかあります。

まず、サンプル準備は高品質なSTORMイメージングの基盤です。ガラス底皿のアミノシラン化は徹底的で、洗浄およびラベル付けの過程でコラーゲン線維の安定的な付着を確保する必要があります。残留APTESは非特異的結合や高背景結合を引き起こす可能性があり、不完全なシラン化は線維剥離を引き起こすことがあります。推奨される超音波処理ステップ(40kHzで10分)は、表面機能性を維持しつつ、結合していないシランを効果的に除去します。コラーゲン線維の架橋には、高特異性のためにEDC/NHSが推奨される²¹ 番です。あるいは0.1%グルターアルデヒド(室温で30分間培養し、その後徹底的に洗浄)を使うこともできますが、特異性は低いです。特に、鉱化に進む前にTEMによる適切な線維形成を確認する...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ポリアスパラギン酸（p-Asp）	Sigma-Aldrich	P9903	アモルファスカジウムリン酸の安定剤
塩化カルシウム（CaCl2）	Sigma-Aldrich	C1016	カルシウム源
二リン酸ナトリウム（Na2HPO4）	Sigma-Aldrich	S0876	リン酸源
塩化ナトリウム（NaCl）	Sigma-Aldrich	S9888	イオン強度の調整剤
ポリアクリル酸（PAA）	Sigma-Aldrich	323667	高濃度カルシウムの安定剤
トリス塩基	Sigma-Aldrich	T1503	バッファ成分
アジ化ナトリウム（NaN3）	Sigma-Aldrich	S2002	抗菌剤
(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン（APTES）	Sigma-Aldrich	440140	ガラス表面機能化剤
無水エタノール	Sigma-Aldrich	459836	溶媒
I型コラーゲン溶液（0.1 M酢酸中50 μg/mL）	Corning	354249	自己集合型足場
コンドロイチン硫酸（CS）	Sigma-Aldrich	C9819	非コラーゲンタンパク質ミミック
EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）	Sigma-Aldrich	E7750	架橋剤
NHS（N-ヒドロキシコハク酸イミド）	Sigma-Aldrich	130672	架橋活性化剤
MES遊離酸	Sigma-Aldrich	M5287	架橋用バッファ
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）	Gibco	10010023	洗浄および希釈バッファ
ウシ血清アルブミン（BSA）	Sigma-Aldrich	A3059	ブロッキング剤
ウサギ抗コラーゲン-I抗体	Abcam	ab34710	コラーゲン用一次抗体
マウス抗コンドロイチン硫酸抗体	Sigma-Aldrich	C8035	CS用一次抗体
ゴート抗ウサギIgG（遠赤色蛍光色素（Alexa Fluor 647）に結合）	Thermo Fisher Scientific	A-21244	コラーゲン用二次抗体
ゴート抗マウスIgM（赤色蛍光色素（Alexa Fluor 568）に結合）	Thermo Fisher Scientific	A-11031	CS用二次抗体
カルセイン（カルシウム指標染料）	Sigma-Aldrich	C0875	リン酸カルシウムラベル
ツイーン-20	Sigma-Aldrich	P1379	洗浄バッファ用洗剤
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516	イメージングバッファ成分
グルコースオキシダーゼ（GOx）	Sigma-Aldrich	G7141	酸素スカベンジャー
カタラーゼ	Sigma-Aldrich	C1345	酸素スカベンジャー
システイナミン（MEA）	Sigma-Aldrich	M6500	フオロフォア点滅用チオール
D-グルコース	Sigma-Aldrich	G6152	グルコースオキシダーゼの基質
酢酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2889	GOx ストック用バッファ
塩酸（HCl）	Sigma-Aldrich	320331	pH 調整
水酸化ナトリウム（NaOH）	Sigma-Aldrich	71690	pH 調整
ホスホタングスチン酸	Sigma-Aldrich	P4006	TEM用のネガティブ染色
ガラス底培養皿（35 mm、#1.5H）	MatTek	P35G-1.5-14-C	サンプル基板; 厚さ 0.17 mm
超音波洗浄器（40 kHz）	Branson	B200	洗浄装置
湿度チャンバー	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	コラーゲン自己集合用
透過型電子顕微鏡	Hitachi	HT7800	TEM イメージング
Formvar/カーボンコーティングTEMグリッド（200 メッシュ）	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	TEM サンプルサポート
水平シェーカープラットフォーム	Labnet	S2030-RC	穏やかな洗浄
共焦点レーザー走査型顕微鏡	Nikon	A1	予備スクリーニング
3D-STORM顕微鏡システム（405/488/647 nm レーザー、円筒レンズ、EMCCD付き）	Nikon	N-STORM	超解像イメージング
100× 油浸観察レンズ（NA 1.49）	Nikon	MRD01991	高解像度イメージング
pHメーター	Mettler Toledo	FiveGo F2	pH 制御
STORM 取得・解析ソフトウェア	Nikon	NIS-Elements（STORM モジュール）	STORM データ取得と処理
.nd2 ファイル形式（生マイクロイメージファイル）	Nikon	N/A	Nikon 顕微鏡で生成される生の画像ファイル形式。
公開されている画像解析ソフトウェア	オープンソース	N/A	例えば、ImageJ と ThunderSTORM プラグインによる単分子局在化解析（コロケーション、ドリフト補正）
パラフィルム	Bemis	PM996	インキュベーション中のサンプルカバー
アルミニウム箔	任意のラボ用品供給業者	N/A	光保護用（例：サンプルのラップ）
アンバー色マイクロ遠心分離管	Fisher Scientific	05-669-21	フオロフォアの光保護用
カブリガラス（No. 1.5）	Corning	2855-18	サンプル取り付け