Focused-Ion Beam Scanning Electron Microscopy Data를 사용한 얇은 세포 이하 신경 구조의 3D 재구성 및 분석

Summary

사용자 친화적인 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용하여 집속 이온 빔 주사 전자 현미경 이미지 볼륨 내에서 얇은 세포 내 뉴런 프로세스를 식별, 시각화 및 정량화하는 유연한 방법론적 파이프라인입니다.

Abstract

최근 주사 전자 현미경 기술의 발전으로 이제 초박형 세포 내 과정의 신속한 3차원(3D) 분석이 가능해졌습니다. 여기에서는 다른 뉴런의 시냅스전 부톤('spinules'라고 함)으로 돌출되는 것과 같은 얇은 뉴런 프로세스를 식별, 시각화 및 분석하기 위한 방법론적 파이프라인을 제시합니다. 이 프로토콜은 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어 패키지를 사용하여 집속 이온 빔 주사 전자 현미경(FIB-SEM) 이미지 볼륨 내에서 형태학적 기준을 사용하여 일반적인 신경 세포 하부 구조를 식별하기 위해 의사 결정 트리를 사용하는 방법을 보여주며, 특히 시냅스전 부톤으로 돌출된 다양한 척추를 식별하는 데 중점을 둡니다. 특히, 이 프로토콜은 뉴런 시냅스 내의 척추를 추적하여 이러한 얇은 세포 내 돌기, 부모 신경돌기 및 시냅스후 파트너의 3D 재구성을 생성하는 방법을 설명합니다. 또한 이 프로토콜에는 FIB-SEM 데이터를 분석하기 위해 무료로 사용할 수 있는 오픈 소스 소프트웨어 프로그램 목록이 포함되어 있으며 시각화 및 게시를 위한 3D 재구성을 개선하기 위한 팁(예: 스무딩, 조명)을 제공합니다. 이 적응형 프로토콜은 FIB-SEM 이미지 볼륨 내에서 세포 내 구조의 신속한 나노 단위 분석에 대한 진입점을 제공합니다.

Introduction

나노미터 두께의 세포 내 구성 요소의 구조-기능 관계에 대한 조사는 종종 3D 시각화 및 분석¹의 이점을 얻습니다. 그러나 연속 단면 투과 전자 현미경 연구는 수백에서 수천 개의 ≥40nm 연속 초박형 단면을 절단하고 정렬하기 위해 다이아몬드 나이프를 사용해야 하기 때문에 시간적으로나 공간적으로 제약을 받았습니다. 이러한 제약으로 인해 얇은(직경 <40nm) 세포 내 구조를 샘플링하고 효과적으로 분석할 수 있는 능력이 제한되었으며, 초박형 연속 절편에 능숙해져야 할 필요성으로 인해 3D 구조 분석 ^2,3의 적용이 저해되었습니다. 그러나 최근 집속 이온 빔 주사 전자 현미경(FIB-SEM)의 발전으로 얻을 수 있는 이미지 볼륨의 속도와 해상도에 혁명이 일어났으며 이제 부드러운 소포체^4,5, 신경 시냅스 ^3,6 및 시냅스 소포 ^7,8과 같은 얇은 세포 내 구조의 정량 분석이 가능합니다 대규모로. 또한 FIB-SEM 이미지 볼륨의 광범위한 사용은 자유롭게 액세스할 수 있는 FIB-SEM 이미지 볼륨 리포지토리⁹ 및 3D 분석 소프트웨어(예: Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴)의 개발을 가속화하여 이 기술의 범위를 확장하고 이제 미세한 세포 내 구조의 구조와 기능에 대한 조사를 가능하게 합니다.

이러한 나노 크기의 세포 내 특징 중 하나는 뉴런 시냅스 'spinule'입니다. 척추는 얇고(~0.06-0.15μm 너비, 0.1-1μm 길이) 한 뉴런에서 나와 다른 뉴런의 신경돌기(예: 시냅스전 부톤)에 의해 캡슐화되는 손가락 모양의 돌기입니다^15,16. 뉴런 돌기에 내재된 척추는 거의 60년 동안 전자 현미경 문헌에 보고되어 왔으며¹⁷ 척추와 같은 돌출부는 흥분성 시냅스의 보존된 18,19,20 및 유비쿼터스 ^21,22 특징입니다. 그럼에도 불구하고, 시냅스 척추(synaptic spinules)의 보급성에도 불구하고, 그 기능은 여전히 불분명하며, 시냅스 척추의 풍부함과 구조적 보존을 설명하는 데 필요한 데이터가 부족합니다. spinules의 이러한 실험적 특성화의 부족은 대부분 spinule 유병률과 크기를 정량적으로 분석하는 데 어려움이 있기 때문입니다. 작은 치수는 이전에는 달성할 수 없었던 z(깊이) 분해능(즉, ≤15nm)을 사용하는 분석에 가장 적합합니다.

여기에서는 FIB-SEM 신규 이민자와 전문가 모두에게 진입점 역할을 할 수 있는 얇은(단면≤40nm 너비) 세포 내 구조를 식별, 시각화 및 분석하기 위한 FIB-SEM 분석 파이프라인이 제시됩니다. 이 프로토콜은 3D FIB-SEM 이미지 볼륨 내에서 신경 세포 하부 구조를 식별하기 위한 프라이머 역할을 하며, 특정 기준을 사용하여 척추 및 시냅스의 하위 유형을 인식하고 분류하는 방법을 강조합니다. 또한 이 프로토콜은 이미지 볼륨을 무료 3D 분석 소프트웨어 플랫폼(Reconstruct)으로 가져오고, 이 소프트웨어를 사용하여 흥분성 뉴런 시냅스 내의 척추를 추적하고, 이러한 세포 내 투영, 부모 신경돌기 및 캡슐화 시냅스전 부톤의 3D 재구성을 생성하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 무료 오픈 소스 3D 렌딩 소프트웨어(Blender)를 사용하여 시각화 및 잠재적 게시를 위해 3D 재구성의 '피부'를 매끄럽게 하는 방법을 보여주며 이 기술의 장점과 잠재적 위험을 자세히 설명합니다.

Protocol

1. 이미지 볼륨 데이터 및 세포 내 개체 크기: 고려 사항 및 등록

1. 관심 있는 세포 이하 물체를 포함하는 관심 영역의 고품질 FIB-SEM 이미지 볼륨을 얻습니다.
   참고: 이 프로토콜은 청소년기 후반 흰족제비 1차 시각 피질(24.2 x 16.2 x 2.4 μm, 4 nm 등방성 복셀)의 FIB-SEM 이미지 볼륨 세그먼트와 Knott 실험실(https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/)에서 제공하는 성체 쥐 CA1 해마(10.2 x 7.7 x 5.3 μm, 5 nm 등방성 복셀)에서 자유롭게 액세스할 수 있는 FIB-SEM 볼륨을 사용합니다. FIB-SEM 이미징 조건에서 초구조적 세부 사항을 보존하고 높은 대비를 생성하는 프로토콜을 사용하여 FIB-SEM을 위한 조직 블록을 준비하는 것이 중요합니다^23,24. 중요한 것은 결과 FIB-SEM 이미지 복셀 해상도가 관심 있는 가장 작은 세포 내 구조의 직경 크기<0.5×이 되도록 조직을 이미지화해야 한다는 것입니다. 예를 들어, 시냅스전 부톤으로 척추 돌출 부위는 직경이 30nm만큼 작을 수 있기 때문에 <15nm의 복셀 크기가 Nyquist 기준 이상에서 이러한 구조를 샘플링하는 데 적합합니다. 또한 등방성(모든 차원에서 동일) 해상도(예: 5 x 5 x 5nm 복셀)로 조직을 이미지화하여 모든 x/y/z 평면에서 동일한 치수를 가진 미세 구조를 시각화하고 재구성하는 데 유용합니다.
2. ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads)의 피지 배포판을 다운로드하여 설치합니다.
3. 이미지 볼륨을 정렬합니다.
   참고: 최신 FIB-SEM 시스템은 대략적으로 정렬된 이미지 볼륨을 생성하지만 이미지 대 이미지 정합은 여전히 하위 픽셀 드리프트로 어려움을 겪을 수 있습니다.
   1. 피지에서 Plugins(플러그인) | 등록을 선택하고 [Register Virtual Stack Slices]를 선택합니다. 도움이 필요하면 사용 설명서를 참조하십시오(https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Rigid 정합으로 시작한 다음 필요한 경우 Affine 기술을 사용합니다.
4. 이미지 볼륨의 크기를 조정합니다.
   1. Fiji에서 File(파일) | 가져오기 | 이미지 시퀀스 를 선택하고 정렬된 이미지가 있는 폴더로 이동합니다.
   2. 대화 상자 창에서 이미지의 이름이 번호 순으로 지정된 경우 Sort names numerically (숫자순으로 이름 정렬 )를 클릭합니다. 더 빠른 피지 성능을 위해 가상 스택 사용을 클릭합니다.
   3. 이미지가 열리면 이미지 | 속성을 선택하고 이미지 볼륨 픽셀의 물리적 크기(마이크로미터)를 픽셀 높이, 너비 및 깊이 상자에 삽입합니다. 가장 오른쪽에 있는 각 상자에 um 또는 μm 을 입력합니다. .tiff File (파일) | 다른 이름으로 저장 | 티파니.
      참고: 이미지 크기가 조정된 경우 이제 이미지 상단에 이미지 크기가 마이크로미터 단위로 표시되어야 합니다(예: 9.82 x 8.65μm).

2. 신경돌림과 시냅스 척추 식별

1. 화살표 키 또는 마우스 휠을 사용하여 스택을 스크롤하는 동안 신경돌기 식별 결정 트리(그림 1)와 절단된 신경돌기의 예(그림 2)를 참조하여 관심 개체를 찾고 식별합니다.
   1. 시냅스 spinules를 시냅스전 또는 시냅스후 중성석 내에서 완전히 둘러싸게 되는 신경돌기에서 막 결합 돌출부로 식별합니다.
      참고: 긍정적인 시냅스 척추 식별을 위해서는 척추 투영 물체 막이 시냅스전 또는 시냅스후 구조의 거꾸로 된 막으로 침입한다는 시각적 증거와 적어도 하나의 이미지에서 시냅스전 또는 시냅스후 구조의 막에 의해 완전히 캡슐화된 막 결합 척추의 존재에 대한 시각적 증거가 필요합니다.
2. 피지에서 관심 지역(ROI) 만들기
   1. 피지 도구 모음에서 적절한 도구(예: 타원형 도구)를 클릭한 다음 이미지를 클릭하고 드래그하여 ROI를 형성합니다. 문자 "T"를 입력하여 ROI Manager에 이 ROI를 기록합니다.
      참고: 이제 ROI Manager 가 이미지 좌표를 기본 이름으로 사용하여 표시됩니다.
   2. ROI Manager에서 Rename(이름 바꾸기) 버튼을 클릭하고 표시되는 텍스트 상자에 원하는 이름을 입력하여 ROI의 이름을 원하는 대로 바꿉니다. 정량적 기준에 따라 ROI의 이름을 바꿉니다(예: 분석되고 시냅스후 척추와 함께 두 개의 시냅스가 있는 12^번째 시냅스전 bouton은 B12_s,s로 명명될 수 있음).
      참고: 각 ROI를 전체 이미지 스택에 표시되지 않고 하나의 이미지 "슬라이스"와 연결하고 단일 이미지에서 ROI 이름을 표시하려면 ROI Manager | 더 보기 | Options(옵션) 창을 클릭한 다음 ROI Manager 하단에 있는 Show All and Labels(모두 표시) 및 Labels(레이블) 확인란을 클릭합니다. 이 단계는 ROI를 개별 이미지가 아닌 전체 이미지 볼륨과 연결하면 볼륨 내의 객체가 이중 계산될 수 있으므로 이미지 볼륨 내에서 ROI를 저장할 때 매우 중요합니다.
   3. 현재 ROI 매니저에 있는 모든 ROI를 파일로 저장하려면 먼저 ROI 매니저에서 Deselect 버튼을 클릭하고, 더 보기 버튼을 클릭한 후 Save까지 아래로 스크롤합니다.
      참고: 이제 이 저장된 .zip 파일을 피지에서 열어 이러한 모든 ROI를 ROI Manager에 다시 로드할 수 있습니다.

3. 관심 영역을 결정하고 이미지 볼륨을 3D 분석 소프트웨어로 전송

1. 전체 이미지 볼륨을 3D 재구성 및 분석 소프트웨어로 전송하는 것이 바람직한지, 아니면 원본 스택에서 더 적은 수의 이미지 및/또는 관심 영역을 분석하기 위해 더 작은 하위 스택(3.3.2 참조)을 생성해야 하는지 여부를 결정합니다.
2. 관심 물체가 포함된 상대적으로 작은 영역에 대해 소규모 '파일럿' 연구를 실행하여 효과 크기와 통계적 비교를 위해 원하는 검정력을 얻는 데 필요한 관심 물체의 수를 추정합니다. 관심 객체를 샘플링하는 데 필요한 영상 볼륨의 크기를 보수적으로 추정하면 이러한 세포 내 객체가 영상 볼륨 내에 불균일하게 분포되어 있는 경우 이를 추정할 수 있습니다.
3. 3D 분석을 위해 이미지 볼륨의 일부를 사용하려면 먼저 이미지 | 복제.
   1. 이미지의 잘린 부분을 분석에 사용하려면 Fiji 도구 모음에서 사각형 도구를 선택하고 원하는 관심 영역을 그립니다. 이를 원하지 않는 경우 다음 단계를 계속합니다.
   2. 이미지로 이동 | 스택 | 도구 | 하위 스택을 만듭니다. 텍스트 상자에 하위 스택에 포함할 이미지 범위를 입력합니다(예: 1 - 500을 입력하여 이미지 1에서 500까지 포함).
   3. 위의 샘플링 고려 사항(1.1 이후 참고)을 참조하여 관심 있는 물체의 크기에 따라 필요한 z-해상도를 결정합니다. 예를 들어, 이미지 볼륨의 복셀 깊이가 5nm인 경우 피지가 서브스택의 다른 모든 이미지를 유지하도록 z 차원에서 10nm 간격으로 관심 객체를 샘플링할 수 있습니다. 이렇게 하려면 범위 뒤에 n번째 이미지의 번호를 입력합니다(예: 1 - 500 이미지 범위에 있는 다른 모든 이미지만 포함하려면 1 - 500 - 2 입력).
      참고: 각 3D 해석 소프트웨어 패키지( 표 1 참조)에는 고유한 파일 가져오기 요구 사항이 있습니다. 이 프로토콜은 .tiff 파일로 저장된 이미지 볼륨을 이미지 볼륨 소프트웨어인 Reconstruct로 가져오는 데 중점을 둡니다.

Reconstruct에서 얇은 세포 내 구조의 4. 3D 재구성 및 분석

참고: Reconstruct를 사용하는 동안 휠이 장착된 마우스를 사용하는 것이 매우 유리합니다. 또한 대부분의 또는 모든 트레이스를 수동으로 수행하는 경우 터치 스크린이 있는 컴퓨터에서 스타일러스를 사용하여 윤곽선을 그리면 트레이스 효율성을 크게 높일 수 있습니다.

1. 기본 또는 가상 환경에서 Microsoft Windows를 실행하는 컴퓨터에서 사용할 수 있도록 Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)를 다운로드하여 설치합니다.
2. 재구성 파일에 대한 새 폴더를 만들고 Series(시리즈) | 새로 만들기, 이 재구성(.ser 파일)을 방금 생성된 폴더에 원하는 파일 이름으로 저장합니다.
3. 저장된 .tiff 이미지 볼륨을 Reconstruct로 가져옵니다.
   1. Series(시리즈) | 가져오기 | 이미지를 보려면 Import Images(이미지 가져오기) 창에서 Select(선택)를 클릭하고 이미지 볼륨 파일을 찾습니다. Import Images(이미지 가져오기) 창에서 볼륨의 각 이미지에 대해 별도의 줄로 표시되는 이미지 볼륨 파일을 찾습니다.
   2. 중요: 픽셀 크기 텍스트 상자에 이미지 볼륨의 x/y 픽셀 크기(μm)에 해당하는 올바른 픽셀 크기를 입력합니다. 이 작업이 완료되면 이미지 가져오기 창에서 가져오기 버튼을 클릭합니다.
      참고: 이미지를 가져오면 Reconstruct 창 중간에 이미지가 있어야 하며 Import Images 목록은 비어 있어야 합니다.
   3. Reconstruct 창 중간에 이미지가 있고 Import Images 목록이 비어 있는 경우 Import Images 창에서 Quit을 클릭합니다.
   4. Section (단면 두께) (즉, 복셀 높이 또는 z 치수)을 Section (단면도) | List sections(섹션을 나열하고 나열된 모든 섹션을 강조 표시한 다음 Modify | 두께를 입력하고 텍스트 상자에 단면 두께(μm)를 입력합니다(예: 5nm 두께의 단면의 경우 0.005).
      참고: 모든 n번째 섹션만 포함하는 더 큰 원본 이미지 볼륨의 하위 스택으로 작업하는 경우(3.3.3단계 참조) 전체 섹션 두께에서 이러한 '누락된' 섹션을 고려해야 합니다. 예를 들어, 원본 이미지 볼륨 섹션 두께(복셀 높이라고도 함)가 0.005μm이고 하위 스택에 세 번째 섹션(예: 1-500-3)만 포함된 경우 이 하위 스택의 섹션 두께는 0.015μm(즉, 0.005μm x 3개 섹션)입니다.
4. 관심 있는 개체의 흔적을 만듭니다.
   1. 시리즈로 이동 | 옵션 | 이름/색상 탭을 사용하여 새 개체에 이름을 지정합니다. 개체 추적의 윤곽선과 내부 채우기에 대한 색을 선택하고 확인을 클릭합니다.
      참고: Reconstruct 는 하나의 개체와 동일한 이름의 모든 추적을 연결하려고 시도합니다. 추적 명명 규칙에 대해서는 Reconstruct 매뉴얼을 참조하십시오(예: 이름에 공백을 포함하지 마십시오). 추적 색상은 단순히 추적을 시각화하기 위한 것입니다. 이 오브젝트의 3D 재구성 색상은 나중에 쉽게 변경할 수 있습니다.
   2. 도구 모음에서 연필 모양의 Draw Freehand 도구를 선택합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 마우스를 드래그하여 개체의 멤브레인을 추적합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 놓으면 추적이 자동 완성됩니다. Page Up / Page Down 을 클릭하거나 마우스 휠을 사용하여 이미지 볼륨의 다음 광학 섹션으로 진행하고 구조가 완료될 때까지 점진적으로 트레이스를 만듭니다.
5. 시냅스 척추 추적
   참고: presynaptic boutons 내에 포함된 spinules는 막으로 둘러싸인 투명한 구조로 나타나며, 때로는 내부에 actin과 같은 전자 불투명 물질 및/또는 막과 같은 주름이 있습니다.
   1. 이미지 볼륨을 통해 진행하고 spinule invagination 부위를 presynaptic bouton으로 찾고, spinule을 소포체, 액포, 엔도솜, 자가포식소체 및 기타 subcellular organelles와 구별하도록 주의합니다.
      참고: 막으로 결합된 소기관과 달리, 시냅스 척추는 항상 신경암/신경교세포(즉, 에버트된 막)에서 돌출하고 시냅스 전 또는 시냅스 후 구조(즉, 역전된 막)에 의해 수신되도록 합니다. 척추 침습의 이러한 시각적 증거는 ≥2 이미지에서 발생해야 하며, 완전히 캡슐화된 막 결합 척추는 ≥1 이미지의 시냅스 전 또는 시냅스 후 구조 내에 존재해야 합니다. 작은 spinules는 clathrin으로 코팅될 수 있습니다. 클라트린으로 코팅된 세포내이입에서 시냅스 전 또는 시냅스 후 뉴라이트로 척추 침습 이벤트를 구별하기 위해, 클라트린으로 코팅된 척추를 확실하게 식별하려면 동일한 이미지 내에서 시냅스전 또는 시냅스후 구조의 역전막으로 돌출된 척추 모체에서 일치하는 상각막의 시각적 확인이 필요한지 확인하십시오.
   2. 이미지 볼륨을 통해 진행하여 부모 중성석/신경교세포에서 척추 투영/기원 위치를 찾습니다. 그림 1 과 그림 2 를 참조하면 이러한 부모 구조를 식별하는 데 도움이 됩니다.
   3. 수용 구조(예: 시냅스전 부톤)로 막 돌출된 부위에서 척추의 추적을 시작하고 캡슐화하는 시냅스 전 또는 시냅스 후 중성석 내에서 막 결합 구조로 나타나는 한 척추를 계속 그립니다.
   4. 마우스 왼쪽 버튼을 계속 누른 채로(또는 터치 스크린 컴퓨터를 사용하는 경우 스타일러스로 척추 막을 따라 계속 그리기) 마우스 포인터로 척추 막을 추적합니다.
   5. 추적이 시작된 지점에 도달하면 마우스 왼쪽 단추를 놓습니다.
      참고: 마우스 왼쪽 버튼을 너무 빨리 놓으면 추적이 자동 완성되어 바람직하지 않은 결과가 나타나는 경우가 많습니다. 이 경우 이 추적이 추적 목록에 강조 표시된 동안 삭제를 누르기만 하면 됩니다.
   6. spinule이 나타나는 모든 섹션에 대해 4.5.2-4.5.5 단계를 반복합니다.
      참고: 적절한 경우 spinule을 bouton 내에서 캡슐화된 멤브레인 결합 구조로 추적하는 것을 잊지 마십시오. Reconstruct 는 캡슐화 구조의 부피에서 캡슐화된 세포 내 구조(예: spinules, subcellular organelles)를 자동으로 빼는 것을 허용하지 않기 때문에 이는 사후적으로 수행할 수 있습니다(예: 단순히 시냅스전 bouton의 총 부피에서 spinule volume을 빼서).
6. Reconstruct에서 3D로 객체 재구성
   1. Series( 시리즈) | 옵션 | 3D 탭을 클릭하고 Traces 라디오 버튼을 클릭했는지 확인합니다.
   2. Objects (개체) | 개체 나열.
   3. 추적된 개체의 이름이 창에 로드되면 개체 목록에서 개체 이름을 두 번 클릭하여 3D로 봅니다. 3D 장면 창이 나타날 때까지 기다립니다.
   4. 추적의 시작, 끝 및 개수가 각 개체에 대한 개체 목록에서 Count = End - Start와 같이 올바른지 확인합니다. 개체에 대한 Count ≠ End - Start인 경우 이 개체의 하나 이상의 추적이 실수로 생략되었을 수 있습니다.
   5. 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 마우스를 움직이거나 마우스 오른쪽 버튼을 누른 상태에서 마우스를 앞뒤로 움직여 확대 및 축소하여 개체의 3D 트레이스를 회전합니다. 개체의 추적이 적절하게 정렬되고 연속적인 각 추적 사이에 부드러운 전환이 있는 것처럼 보이는지 확인합니다.
   6. 필요한 경우 개별 추적을 다시 추적하여 날카로운 가장자리 및/또는 추적 간 전환으로 이어지는 오류를 제거합니다.
   7. 사면체 메쉬 스킨 을 개체에 적용하여 Series | Object | 3D 탭을 클릭하고 Boissonnat 표면 라디오 버튼을 클릭합니다.
   8. 3D Scene 창에서 Scene(씬) | 선택을 취소한 다음 Object List(개체 목록)에서 원하는 개체 이름을 두 번 클릭합니다.
   9. 추적 간의 원활한 전환을 위해 개체를 회전하고 필요한 경우 추적을 다시 그립니다.
   10. 개체 색상과 투명도를 변경하려면 개체 목록에서 개체 이름을 클릭한 다음 Scene | 색상/투명도... 개체 목록 메뉴에서. 개체 목록에서 개체 이름을 두 번 클릭하면 3D 장면 창에서 이 변경 사항을 볼 수 있습니다.
       참고: 개체 색상, 투명도 및 스무딩은 블렌더를 사용하여 더 높은 수준의 제어와 특이성으로 변경할 수 있습니다(5.4-5.6 참조).
7. 3D 물체의 정량 분석
   1. Series( 시리즈) | 옵션 | 목록 탭을 클릭하고 이 창의 개체 목록 및 추적 목록 섹션에서 원하는 모든 측정값을 클릭합니다.
   2. Object List(개체 목록)(Object | 목록 개체 ...) 그런 다음 목록 | 저장을 탭합니다.
   3. Object List(개체 목록)에 표시된 대로 개체 측정값을 쉼표로 구분된 파일(.csv)로 저장합니다.
   4. .csv 파일을 선택한 데이터 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 스프레드시트(예: Microsoft Excel)로 가져오려면 파일을 두 번 클릭하거나 비어 있는 새 통합 문서를 열고 파일 | 가져오기 | CSV 파일 옵션을 선택하고 지침을 따릅니다.
   5. 물체 사이의 거리를 3D로 측정하려면(예: 시냅스전 보톤 내에서 시냅스 척추의 투영 거리를 측정하기 위해) Reconstruct의 Z-trace 함수를 사용합니다.
   6. 먼저 Series | 옵션 | 이름/색상 탭을 클릭하고 Z 추적의 이름을 입력합니다.
   7. 그런 다음 도구 모음에서 Z-trace 도구를 클릭합니다.
   8. 시냅스 척추의 투영 거리의 Z-트레이스를 그리려면 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 시냅스 척추의 시작 부분을 클릭한 다음 Page Up 또는 Page Down 버튼을 눌러 각 섹션 내에서 시냅스 척추막을 따라 연속적인 점을 클릭하면서 이미지 볼륨을 통해 진행합니다.
   9. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 이 Z-trace를 완료합니다.
   10. Trace | 추적 나열... Trace List(추적 목록)를 불러온 다음 List(목록)를 클릭합니다. 저장 - 추적 목록 측정값을 .csv 파일로 저장합니다.
8. 스케일 큐브 추가
   1. 스택의 첫 번째 또는 마지막 이미지 중 하나로 이동합니다.
   2. 시리즈로 이동 | 옵션 | 이름/색상 탭을 클릭하고 배율 큐브의 이름을 입력합니다.
   3. 도구 모음에서 Draw Rectangle 도구를 선택하고 개체에 인접하지만 개체를 가리지 않는 작은 사각형(크기는 중요하지 않음)을 그립니다. 시리즈로 이동 | 옵션 | 3D 탭, 생성 영역에서 상자 라디오 버튼 옵션을 클릭하고 크기 영역의 A:, B:, C: 상자에 치수를 입력하여 스케일 큐브의 크기(μm)를 지정합니다(예: 0.5μm/측면 스케일 큐브를 생성하려면 A, B, C에 0.5 입력).
      참고: 3D에서 스케일 큐브를 재구성하기 전에 추적 또는 Boissonnat 표면 옵션을 사용하여 3D 장면에서 원하는 3D 개체를 이미 재구성했는지 확인하십시오. 배율 조정 큐브를 재구성한 후(즉, 4.8.5단계 이후) Generate 옵션을 Boissonnat surface 로 다시 변경하고 A, B 및 C의 크기를 다시 -1 로 변경해야 합니다.
   4. Object List를 열고 스케일 큐브의 이름을 두 번 클릭합니다. 배율 조정 큐브가 3D 장면 창에 나타날 때까지 기다립니다.
   5. 스케일 큐브를 다른 오브젝트에 상대적으로 이동하려면 Series | 옵션 | 3D 탭을 클릭하고 스케일 큐브를 X, Y 및/또는 Z 상자로 이동하려는 μm 수를 입력합니다. OK(확인)를 클릭하여 창을 닫은 다음 Object List(개체 목록)에서 배율 조정 큐브의 이름을 두 번 클릭합니다.
      참고: 또는 블렌더를 사용하여 이 작업을 수행할 수 있습니다(아래 참조).

5. Blender에서 3D 재구성에 가져오기, 다시 칠하기, 매끄럽게 하기 및 투명도 추가

알림: 블렌더 사용에 대한 자세한 지원은 블렌더 설명서 및/또는 각 블렌더 기능 사용에 대한 수많은 "방법" 비디오를 참조하십시오( 블렌더 및 원하는 기능에 대한 웹 검색을 수행하기만 하면 됨). 다음은 3D 재구성에 다시 칠하고, 매끄럽게 하고, 투명도를 추가하는 방법에 대한 간단한 입문서입니다.

1. 무료 오픈 소스 3D 소프트웨어 제품군(www.blender.org)인 Blender의 최신 버전을 다운로드하여 설치하십시오.
2. Reconstruct(재구성)에서 3D 장면 창에서 원하는 개체를 불러온 다음 Scene(장면) | 다른 이름으로 내보내기 | VRML 2.0입니다.
3. 블렌더에서 File(파일) | 가져오기 | X3D 확장 가능한 3D(.x3d/.wrl). Reconstruct에서 저장된 VRML 2.0 파일을 클릭한 다음 Import X3D/VRML2 버튼을 클릭합니다.
4. 재구성을 다시 칠합니다.
   1. 장면 컬렉션 창의 오른쪽 상단 모서리에서 기본 큐브 개체에 대한 눈 아이콘을 클릭하여 선택 취소/선택 취소하고 개별 개체의 이름을 클릭하여 장면의 각 개체를 강조 표시합니다. 이러한 개체의 이름을 적절하게 바꿉니다.
   2. Scene Collection 창에서 다시 칠할 첫 번째 개체의 이름을 클릭합니다.
   3. 원형 컨텍스트를 클릭합니다. Material 아이콘을 클릭하고 Add Material을 클릭합니다. 옵션 목록이 아래에 나타나야 합니다. 그런 다음 Base Color 옵션 옆에 있는 막대를 클릭하고 개체에 대해 원하는 휘도와 색조를 선택합니다.
   4. 오브젝트의 금속성 모양, 광택 및 반사 품질을 변경하려면 Metallic, Specular, Roughness 및 Sheen 옵션을 조정하여 원하는 효과를 생성합니다.
      참고: 씬에 특정 옵션(예: 투명도, 광택)이 표시되려면 뷰포트 셰이딩: 룩 데브(Viewport Shading: Look Dev ) 또는 뷰포트 셰이딩: 렌더링된 뷰포트(Viewport Shading: Rendered viewport) 세팅에 있어야 할 수 있습니다. 뷰포트 설정 중 하나로 변경하려면 오른쪽 상단의 지구본 아이콘 위로 마우스를 가져가 원하는 뷰포트 설정을 클릭합니다.
   5. 조명 각도를 변경하려면 Scene Collection 창에서 Light 개체를 클릭하고 오른쪽 상단의 Show Gizmo 아이콘을 클릭한 다음 장면 주위로 조명을 드래그하여 원하는 조명 효과를 얻습니다. 라이트 오브젝트를 선택할 때 장면 컬렉션 창 아래에 나타나는 오브젝트 데이터 창에서 라이트 강도를 변경합니다.
   6. 선택한 축에서 개체를 개별적으로 회전하려면 장면 컬렉션 창에서 개체 이름을 클릭하고 R 키를 누른 다음 회전 축의 문자(x, y 또는 z 키)를 클릭하고 마우스를 이동하여 원하는 회전을 생성합니다. 개체를 잡고 이동하려면 장면 컬렉션 창에서 개체를 선택하고 G 키를 누른 다음 마우스를 사용하여 장면에서 개체를 이동합니다.
5. 재구성을 다시 메쉬(즉, 매끄럽게)합니다.
   1. Scene Collection 창에서 관심 있는 개체의 이름을 클릭한 다음 짐볼과 마우스 휠을 사용하여 개체를 가운데에 배치하고 확대합니다.
   2. 아이콘의 오른쪽 스트립에 있는 Context.Modifiers 렌치 아이콘을 클릭하고, Add Modifier를 클릭한 다음, Remesh ( Generate 제목 아래)를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 스무스(Smooth)를 선택하고, 스무스 셰이딩(Smooth Shading ) 버튼을 클릭하고, 옥트리 뎁스(Octree Depth ) 와 스케일(Scale ) 을 변경하여 원하는 부드러움을 얻을 수 있습니다.
      참고: 뷰포트 셰이딩: 와이어프레임(Viewport Shading: Wireframe ) 창(오른쪽 상단의 지구본 아이콘 옵션)에서 메싱하는 동안 결과를 직접 보는 것이 좋습니다. Remeshing은 개체에 다른 크기의 사면체 메쉬를 만듭니다. 개체를 매끄럽게 하여 단면 또는 트레이싱 아티팩트를 제거하는 동안 원래 모양과 윤곽을 유지하도록 주의하십시오. 옥트리 뎁스 = 7, 스케일 = 0.95에서 시작한 다음 필요한 경우 이 숫자를 천천히 줄입니다. spinules 및 시냅스후 밀도와 같은 작고 얇은 물체에 특히 주의를 기울이십시오.이러한 물체의 부피가 작으면 원래 모양을 변경하지 않고 수행할 수 있는 평활화 범위가 줄어들기 때문입니다.
6. 개체에 투명도를 추가합니다.
   참고: 다른 객체(예: 시냅스전 부톤) 내에 있는 한 객체(예: spinules, presynaptic vesicles, mitochondria, endosomes)의 3D 관계를 표시하는 것이 바람직할 때 객체를 투명하게 만드는 것이 중요합니다.
   1. Scene Collection 창에서 원하는 개체 이름을 클릭합니다. 컨텍스트 하단으로 스크롤합니다. 머티리얼 창(오른쪽 리스트의 오른쪽 하단 아이콘)에서 세팅 섹션을 열고 드롭다운 메뉴를 사용하여 블렌드 모드를 알파 블렌드로 변경합니다. 다음으로, 표면 섹션을 열고 알파까지 스크롤한 다음 숫자를 1보다 작은 값(1 = 완전 불투명, 0 = 완전 투명)으로 변경합니다.
7. 3D 재구성의 스냅샷을 내보냅니다.
   1. 3D 재구성을 위한 최적의 색상, 스무딩 및 조명을 얻었으면 메뉴 제목 창을 클릭하고 스크린샷 저장을 선택하여 장면 내에 이미지를 저장합니다.
   2. 왼쪽 하단의 Save Screenshot(스크린샷 저장 ) 옵션에서 원하는 파일 형식, 색상 형식 및 압축을 선택합니다.
   3. 위의 파일 이름 텍스트 상자에 새 스크린샷의 이름을 입력한 다음 원하는 위치에 스크린샷을 저장합니다.

Results

Quantifying the percentage of synaptic spinules within the excitatory presynaptic bouton population in ferret primary visual cortex(페럿 1차 시각 피질에서 흥분성 시냅스전 부톤 개체군 내 시냅스 척추의 백분율 정량화)
신경돌기에서 흥분성 시냅스전 부톤으로의 가시돌림(spinule-like protusion)이 수십 년 동안 관찰되어 왔지만,^19,26 시냅스 기능에 대한 잠재적인 중요성은 여전히 불분명합니다. 이러한 실험은 발달 이정표와 관련하여 시냅스 기능에 대한 척추의 잠재적 중요성을 확인하기 위해 페럿 1차 시각 피질(V1)에서 출생 후 발달 전반에 걸쳐 척추를 포함하는 흥분성 시냅스전 부톤의 비율을 결정하기 위해 고안되었습니다. 따라서, 정렬된 4nm/voxel 등방성 FIB-SE...

Discussion

이 FIB-SEM 이미지 볼륨 분석 파이프라인은 얇은 세포 내 구조에 대한 신뢰할 수 있는 3D 재구성 및 정량적 측정을 생성할 수 있습니다. 심층 신경망(deep neural network) 및 세분화(segmentation) 알고리즘을 사용하는 현재의 반자동 기법은 큰 이미지 볼륨 내에서 상대적으로 높은 막 대비를 갖는 세포 구조를 재구성하는 속도와 효율성을 높일 수 있지만(³³), 많은 세포 내 구조(예: spinules, smooth endoplasmic reticula, endosomes)는 낮은 막 대비 및/또는 비틀림으로 인해 자동화된 방법을 사용하여 안정적으로 캡처하기 어렵습니다. 새로운 방법이 더 높은 대비의 미토콘드리아와 거친 소포체를 포착하기 시작했지만,^34,35. 더욱이, 표지되지 않은 세포 내 구조...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
피지 (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruct			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org