자기조립형 재조합형 I 콜라겐 섬유에서 콜라겐 광화를 위한 다색 3D-STORM 고해상도 시각화 프로토콜

Summary

여기서는 최적화된 표지, 영상 촬영, 정량적 공위치화 분석을 통합하여 재조합 콜라겐 섬유에서 섬유 내 광화와 섬유외 광화를 구분하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

이 프로토콜은 재조합 타입 I 콜라겐 자기조립 섬유 모델에서 콜라겐 광물화의 나노 규모 시각화를 위한 다색 3차원 확률 광학 재구성 현미경(3D-STORM) 방법을 설명합니다. 이 방법은 콜라겐, 비콜라겐 단백질(예: 콘드로이틴 황산), 인산칼슘 광물 상의 동시 영상화를 가능하게 합니다. 샘플 준비는 아미노-실란화와 콜라겐 자기 조립을 포함하며, 이어서 인산칼슘 배지를 이용한 광물화가 초기 단계(30분)에 비정형 인산칼슘(ACP)을 형성하고 6시간 내에 하이드록시아파타이트(HAP)로 성숙합니다. 다중화 면역형광 표지가 수행되고, 샘플은 먼저 공초점 현미경으로 평가한 후 산소 청소 영상 완충제를 이용한 3D-STORM 이미지 획득을 진행합니다. 데이터 처리 및 분석은 공개된 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 기존의 전자 현미경이나 공초점 현미경과 비교할 때, 이 프로토콜은 분자 특이성과 나노 해상도(일반적인 측면 정밀도 20–30 nm, 축방향 50–60 nm)를 결합하여 섬유 내와 외섬유 광화의 3차원 시각화를 가능하게 합니다. 대표적인 결과는 3차원 공간 내에서 콜라겐 네트워크, 관련 비콜라겐 단백질, 광물 상을 명확하게 시각화했음을 보여줍니다. 피어슨 상관계수(0.89 ± 0.04)와 맨더스 중복 계수(0.91 ± 0.03)를 포함한 정량적 지표는 결과 섹션에 제공된다. 이 프로토콜은 광화 역학에 대한 나노스케일의 통찰이 필요한 생체재료 과학, 생체광물화, 골 조직공학 연구자들에게 강력한 도구를 제공합니다.

Introduction

콜라겐 광화는 뼈와 치아와 같은 단단한 조직 형성에 중요한 근본적인 생물학적 과정입니다^. 콜라겐 섬유의 정교한 구조와 미세하게 조절된 광물 침착 조절은 이 조직들에 놀라운 기계적 강도와 구조적 완전성을 부여합니다². 콜라겐은 단순한 수동적 발판이 아니라 복잡한 분자 및 물리적 상호작용을 통해 정밀한 광물 침착을 조율하는 능동적 참여자로 작용합니다^. 이러한 메커니즘을 밝히는 것은 골다공증과 충치와 같은 병리학적 상태를 이해하고, 재생 치료용 생체 모방 물질 개발에 매우^{중요합니다.}

경조직 내 콜라겐 섬유의 직경은 약 50에서 100 nm 사이이며, 하이드록시아파타이트(HAP) 입자는 더 작아(일반적으로 두께 2–5 nm, 길이 20–30 nm) 섬유질 틈 내에 삽입되어 있습니다^. 갭 존은 핵생성 부위로 작용할 수 있지만, 토착 조직에서는 광물이 처음에 섬유 간 공간에서 형성되어 이후 섬유 내 구획으로 확장됩니다. 전통적인 특성 분석 방법으로는 조직학적 염색, 공초점 레이저 주사 현미경 ^6,7, 전자현미경 ^8,9가 있습니다. 조직학적 염색은 거시적 평가를 제공하지만 나노 규모의 광화 상태를 평가할 수는 없습니다. 공초점 현미경은 특정 성분을 관찰할 수 있으나 회절 제한(~200 nm 측면)으로 섬유 내 광화와 섬유외 광화를 구분할 수^{없습니다.} 전자현미경은 높은 해상도를 제공하지만 분자 특이성이 부족합니다. 면역골드 표지는 전자현미경에서 분자 특이성을 제공할 수 있지만, 특수 처리가 필요하고 STORM에 비해 다중 성분의 다중화 3차원 시각화에 덜 적합하고, 긴 실험 주기와 높은 비용을 요구합니다^.

확률적 광학 재구성 현미경(STORM)은 개별 형광체를 고정밀도로 위치시켜 회절 한계를 극복하여 ~20 nm 횡방향 해상도¹²를 달성합니다. 자극 방출 고갈(STED)¹³현미경 및 구조화 조명 현미경(SIM)¹⁴와 같은 다른 초해상도 기법과 비교할 때, STORM은 더 높은 위치 정밀도(수평 ~20 nm, 축 방향 ~50 nm)를 제공하며, 더 넓은 범위의 유기 형광체와 호환됩니다. 특히 STED는 생물학적 샘플을 손상시킬 수 있는 특수 염료와 높은 레이저 출력이 필요한 반면, SIM은 약 100 nm 해상도만 제공하여 섬유질 규모(50–100 nm) 특성을 해석하기에는 부족합니다. STORM은 해상도, 다중화 기능, 샘플 호환성 사이에서 실질적인 균형을 제공합니다. 발표된 가이드라인에서는 STORM 영상 매개변수 최적화와 해상도 평가를 용이하게 하기 위한 표준화된 시험 샘플을 설명하고 있습니다^. 3차원 영상 기술과 결합되면, 3D-STORM은 여러 구성 요소의 나노스케일을 동시에 시각화할 수 있게 합니다^. 최근 발전으로 STORM은 다색 및 다중화 영상으로 확장되어 동일한 샘플 내에서 여러 표적을 시각화할 수 있게 되었습니다^17,18.

이 프로토콜은 자기조립 재조합형 1형 콜라겐 섬유를 기반으로 한 생체모방 시험관 내 모델을 사용하며, 나노 스케일에서 섬유 내와 섬유외 광물화를 구분하기 위해 시험관 내 재조합 콜라겐 자기 조립 섬유 모델에 명시적으로 설계되었습니다. STORM은 고정 샘플과 산소 제거 버퍼가 필요하기 때문에 라이브 셀 영상에는 적합하지 않습니다. 또한 사전 탈석화나 항원 회취 없이 고광화된 천연 조직(예: 성숙한 뼈)에는 적합하지 않습니다. 전체 광물 밀도나 넓은 면적 형태만 평가해야 할 경우, 기존의 공초점 현미경이나 전자현미경이 더 효율적입니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 다색 3D-STORM을 사용하여 개별 콜라겐 섬유 내 미네랄 및 비콜라겐 단백질의 나노스케일 분포를 시각화하는 표준화된 단계별 워크플로우를 제공하는 것이며, 특히 섬유 내 광물화와 섬유외 광화를 구분하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 최적화된 면역표지와 맞춤형 영상 버퍼를 통합하여 여러 유기 성분(콜라겐, 비콜라겐 단백질)과 무기상(ACP, HAP)을 3차원에서 동시에 추적할 수 있게 합니다¹⁹. 주요 혁신 중 하나는 섬유내와 섬유외 광화의 양상을 정량적으로 평가하는 것입니다. 정량화는 두 가지 독립적인 기준으로 이루어집니다: (1) 이미지 분석 소프트웨어의 공동출소 모듈을 이용해 미네랄(칼슘 지시 염료(예: 칼세인))과 콜라겐(원적색 형광 염료) 채널 간의 피어슨 공동위치 계수를 계산하는 것(계수 >0.8은 강한 연관성을 나타냅니다); (2) 개별 섬유의 Z-슬라이스 전체에 걸쳐 광물 신호의 지속 상태를 분석하는 것: 광물 신호가 섬유 수직 중심에서 Z = 0에서 ±120 nm 거리)에 최대 강도≥50%로 존재한다면, 이는 섬유 내 신호로 분류된다. 기존의 전자현미경이나 공초점 현미경과 달리, 이 프로토콜은 분자 특이성과 나노 해상도를 결합하여 섬유 내 광물화의 3차원 공간 분포를 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 광화 역학에 대한 나노스케일의 통찰이 필요한 생체재료 과학, 생체광물화, 골 조직 공학 연구자들을 위해 설계되었습니다. 표준화된 절차는 탈석화된 상아질 슬라이스나 콜라겐 기반 하이드로겔과 같은 다른 광화된 콜라겐 시스템을 연구하는 데에도 적용할 수 있으며, 초기 샘플 준비 단계를 조정하여 연구할 수 있습니다.

Protocol

생물학적 샘플을 이용한 모든 실험은 저장대학교 의과대학 핵심 시설의 지침과 규정에 따라 수행되었으며, 기관 생명안전위원회(승인 증명서 번호)의 승인을 받았습니다. BSL20235710079). 여기서 설명된 실험 프로토콜은 상업적으로 조달된 시약과 시험관 내 생체 모방 시스템을 사용합니다. 이 검사는 인간 참가자, 동물 대상, 또는 인간 조직 샘플을 포함하지 않으므로 기관 심사 위원회의 윤리적 승인을 요구하지 않습니다.

주의: 유해 화학물질이 관련된 모든 절차는 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 안전 고글)와 함께 연기함 내에서 반드시 수행되어야 합니다. 화학 폐기물은 기관 규정에 따라 처리해야 합니다. NaN₃의 경우, 폐기물을 '아지드 폐기물'이라고 표시된 전용 용기에 수집하고, 산과 섞지 마세요(폭발성 가스 위험). 글루타알데히드의 경우, 폐기 전에 10% 과잉 비아황산나트륨으로 비활성화하세요. β-머캅토에탄올은 배수기 폐기 전에 표백제(1:10 v/v)로 1시간 산화하세요.

참고: 광물 퇴적물에 의한 에피토프 마스킹을 방지하기 위해 면역형광 표지는 반드시 광물화 전에 수행되어야 합니다. 광화 후 표지가 필요한 응용 분야에서는 항원 추출이 필요할 수 있습니다.

1. 광화 매체 준비

1. 재구성된 콜라겐 섬유를 위한 광물화 배지 준비
   1. 15mL 원뿔관 내 5 mg/mL 폴리아스파르트산 100 μL (p-Asp, Mw 9-11 kDa)를 3.44 mM CaCl₂ 용액 5 mL에 떨어뜨리듯 첨가하여 칼슘 스톡 용액을 준비합니다.
   2. 튜브 안에서 30초 동안 소용돌이를 섞어 균질화합니다.
   3. p-Asp를 천천히 첨가하고 충분히 섞어 비정질 인산칼슘(ACP)을 안정화시킵니다.
   4. 칼슘 스톡 용액에 인산염 용액 5mL(19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl)를 첨가합니다.
   5. 1분간 보텍스 믹스.
      참고: 혼합 후 최종 농도: 1.67 mM CaCl₂, 9.5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl, 50 μg/mL p-Asp.
   6. 사용 전에 즉시 광물화 매체를 준비하세요. 보관하지 마세요; 일관된 결과를 얻기 위해 불안정한 ACP 전구체를 즉시 사용하세요.
      참고: 저장은 조기 결정화를 초래합니다.
2. 콜라겐 젤/탈미탈화된 상아질용 미네랄화 배지 준비
   1. 8.77g NaCl, 0.01g NaN₃, 6.06g Tris, 1.11g CaCl₂를 800mL 탈이온수에 녹여 칼슘 함유 용액을 준비합니다.
   2. 부피를 1L로 데이온수로 넣으세요.
   3. 칼슘 함유 용액에 350 μg/mL 폴리아크릴산(PAA, Mw ~1800)을 첨가합니다.
   4. 1분간 보텍스.
      참고: 칼슘 농도가 높을 때 더 나은 안정화를 위해 p-Asp 대신 PAA를 사용하세요.
   5. 인산염 용액을 1리터 탈이온수에 녹여 6 mM Na₂HPO₄를 만듭니다.
   6. 0.22 μm 두께의 막을 사용해 인산염 용액을 여과-멸균합니다.
   7. 칼슘과 인산염 용액을 각각 500mL씩 같은 부피로 300rpm 자기 교반과 함께 섞습니다.
   8. pH 미터로 모니터링하면서 1M HCl 또는 NaOH를 사용해 pH를 7.4로 조절하세요.
      참고: pH는 7.4 ± 0.1로 유지하세요. 조기 결정화를 일으키는 pH 편차>0.2를 허용하지 마십시오.

2. 재조합 콜라겐 섬유의 준비

1. 유리바닥 접시의 아미노 규란화
   참고: 이 처리는 (3-아미노프로필) 트리에톡실란(APTES)을 사용하여 유리 표면에 양전하를 띤 아미노기(-NH₂)를 도입하여, 음전하를 띤 콜라겐 단량체의 정전기 흡착과 안정화를 촉진합니다.
   1. 각 유리 바닥 배양 접시(35mm, #1.5H 두께, 0.17 mm ± 0.005 mm)에 200 μL APTES 용액(절대 에탄올 내 5% v/v)을 첨가합니다.
   2. APTES 용액으로 접시 표면을 완전히 덮으세요.
   3. 실온(20–25 °C)에서 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다.
   4. 설거지를 절대 에탄올(세차당 2mL)로 세 번 헹구세요.
   5. 40kHz에서 10분간 탈이온수에서 초음파 처리를 합니다. 비특이적 결합을 막기 위해 잔류 APTES를 완전히 제거하세요.
   6. Silanized 접시는 4°C에서 최대 1주일간 건조 보관할 수 있습니다.
   7. (선택 사항) 안정성 향상을 위해 구워: 씻고 건조한 그릇을 100–120°C에서 오븐에 30–60분간 넣습니다.
   8. 진행하기 전에 실온까지 식히세요.
      참고: 플라스틱 접시를 사용할 경우, 변형을 방지하기 위해 온도를 80°C 이하로 낮추세요. Bitter와 Muir²⁰의 실란화 절차를 적용하세요.
2. 콜라겐 자기 조립과 가교
   1. 각 실란화 접시에 100 μL 콜라겐-I 용액(50 μg/mL, 0.1 M 아세트산)을 피펫으로 채웁니다.
   2. 37°C에서 습도가 높은 챔버(상대습도 90%>)에서 10시간 부양하세요. 용액 증발을 막기 위해 습도를 유지하세요.
   3. 위상 차이 현미경 또는 공초점 현미경으로 섬유 형성을 확인; 성공적인 준비는 미세하고 거미줄 같은 섬유망을 보여줍니다.
   4. 초구조 수준에서 적절한 섬유 형성을 검증하기 위해, 동일한 자기 조립 조건(콜라겐-I 50 μg/mL, 37 °C, 10시간, 습도 > 90%)을 따라 폴리비닐 형식/탄소 코팅 TEM 격자에 별도의 샘플을 준비합니다.
   5. 1% 인산산(pH 7.0)으로 10분간 염색하세요.
   6. 이온수 제거수로 세척하세요.
   7. 투과전자 현미경으로 관찰하세요. 성공적인 섬유질 생성은 특징적인 67 nm D-주기 밴딩 패턴으로 표시됩니다( 그림 3 참조).
   8. 유리 바닥 접시에서 잔류 콜라겐 용액을 조심스럽게 흡입하세요.
   9. 각 접시에 2mL의 콘드로이틴 황산염(CS) 용액(PBS 50 mg/mL, pH 5.5)을 추가하세요.
   10. 4°C에서 12시간 배양하여 CS가 콜라겐 섬유에 정전기적으로 흡착되도록 합니다.
   11. EDC/NHS 가교결합 용액²¹을 준비: 0.2 M EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드)와 0.05 M NHS(N-하이드록시숙신니마이드)를 MES 버퍼(0.1 M MES, pH 5.5)에 용해합니다.
       참고: MES 완충제는 MES 자유산을 탈이온수에 녹이고 NaOH로 pH를 5.5로 조절하여 제조할 수 있습니다.
   12. CS 용액을 제거하고 EDC/NHS 가교결합 용액 2mL를 추가하세요.
   13. 실온에서 2시간 배양하여 콜라겐 위에 CS를 공유 공유 고정시키세요.
   14. 접시를 PBS로 세 번 씻으세요(각각 5mL씩, 각각 5분씩). 반응하지 않은 시약을 제거합니다.
   15. 가공된 콜라겐 섬유는 광화되기 전 최대 24시간 동안 PBS 4°C에 보관됩니다.

3. 면역형광 표지 (광물화 이전에 시행)

1. 샘플 준비
   1. 콜라겐 섬유는 500 mM NaCl 용액으로 세 번 헹구세요(한 번 세척당 10 mL, 각각 5분).
   2. 탈이온수로 세 번 세척하세요(한 번 10mL씩, 각 5분).
   3. 50rpm으로 회전하는 수평 셰이커 플랫폼에서 세척을 수행하여 조립된 섬유가 분리될 수 있는 전단력을 최소화하면서 철저한 세척을 보장합니다.
2. 차단 및 1차 항체 배양
   1. 블로킹 버퍼(5% 소 혈청 알부민 포함 PBS)를 37°C에서 1시간 동안 가습 챔버에서 인큐베이션합니다.
   2. 차단 버퍼에 항체 혼합물을 준비하세요: 토끼 항콜라겐-I(1:100 희석)과 마우스 항콘드로이틴 황산염(1:100 희석).
   3. 샘플당 200 μL 항체 혼합물을 추가하세요.
   4. 샘플을 실험실 밀봉 필름으로 덮으세요.
   5. 4°C에서 하룻밤(12–16시간) 배양합니다.
   6. 알루미늄 호일을 사용해 빛으로부터 보호하세요. 1차 항체 배양 후에는 4°C의 PBS에 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다.
3. 2차 항체 염색
   1. 세척 버퍼(0.1% Tween-20 in PBS)로 세 번, 각 세척마다 10분씩 씻어 미결합 1차 항체를 제거하세요.
   2. 형광 2차 항체 혼합물을 차단 버퍼(35mm 접시당 200 μL)에 준비하며, 염소 항토끼 IgG가 원적색 형광 염료(1:100)에 접합됨과 염소 항생쥐 IgM이 적색 형광 염료에 접합됨(1:100)을 포함합니다.
      참고: 이 단계부터는 시료를 빛으로부터 보호하여 형광포체의 광표백을 방지하세요.
   3. 샘플을 실온(20–25 °C)에서 어둠 속에서 1시간 배양합니다.
   4. 세척 완충제를 사용해 설거지를 세 번(각 10분) 씻어 결합하지 않은 2차 항체를 제거하세요.
      참고: 표지된 샘플은 영상 촬영 전 최대 48시간 동안 PBS에 4°C(광 차단)에서 보관하십시오. 자가형광을 확인하기 위해 1차 항체 무대 대조군을 포함하세요.

4. 콜라겐 섬유의 광물화 (라벨링 후 수행)

1. 광화 과정
   1. 접시당 신선하게 준비한 미네랄화 배지 2mL를 추가하세요.
   2. 초기 단계의 광물(ACP) 형성을 위해 37°C에서 30분간 단기적으로 배양하세요.
   3. 또는 37°C에서 6시간(장기) 배양하여 성숙 광물(HAP) 결정화를 진행할 수 있습니다.
      참고: 보정된 인큐베이터를 사용해 정확한 온도를 37 °C ± 0.5 °C로 유지하세요.
   4. 미네랄라이징 매체를 부드럽게 흡입하세요.
   5. 탈이온수로 세 번 세척하세요(세탁당 5mL, 1분 간격).
2. 인산칼슘 표지
   1. PBS에 칼슘 지표 염료(예: 칼세인) 4 μM을 첨가합니다(접시당 200 μL).
   2. 실온(20–25°C)에서 어둠 속에서 30분간 배양하세요.
      참고: 칼슘 지표 염료(예: 칼세인)는 칼슘 이온에 결합하여 비정질 상과 결정상을 구분하지 않습니다; 상 할당은 광물 채굴 시간(30분 = ACP, 6시간 = HAP)을 기준으로 합니다. 호박 튜브나 호일 랩으로 빛으로부터 보호해야 합니다.
   3. 다섯 번 헹구세요: 탈이온수로 세 번 세척하고, 70% 에탄올로 두 번 세척(각각 1분씩)을 번갈아 가며 사용하세요.
3. 영상 샘플 준비
   1. 영상 버퍼에 샘플을 담가: PBS에 10% (w/v) 글리세롤. 제조사 설명서에 따라 선택적으로 안티페이드 시약을 추가하세요.
   2. 샘플을 덮을 수 있을 만큼 충분한 부피(20–50 μL)의 영상 버퍼를 적용합니다.
   3. 샘플 위에 커버 슬립을 덮어주세요.
   4. 샘플은 4°C에서 최대 72시간 동안 어두운 상태로 보관합니다.

5. 레이저 공초점 현미경 관찰

1. 샘플을 4 °C 저장에서 실온(20–25 °C)으로 옮깁니다.
2. 결로를 막기 위해 10분간 평형을 유지하세요.
3. 호박 용기나 호일 랩을 사용해 가벼운 보호를 유지하세요.
4. 영상 버퍼가 샘플 전체를 덮고 있는지 확인하세요.
5. 공초점 현미경을 다음 설정으로 구성하세요:
   1. 콜라겐 영상(원적색 형광 염료): 647 nm 레이저, 방출 필터 650-710 nm.
   2. 인산칼슘 영상(칼슘 지시 염료(예: 칼세인)): 488 nm 레이저, 500-550 nm 방출 필터.
   3. 목표: 100× 오일 침수 (NA 1.4).
   4. 핀홀 직경: 1 에어리 유닛 (AU).
   5. 픽셀 체류 시간: 1-2 μs.
      참고: 영상 촬영 전에 레이저 정렬과 핀홀 보정을 수행하세요.
6. 순차 스캔을 수행하세요: 첫 스캔은 647nm 여기(콜라겐)입니다.
7. 488nm 여기(광물)로 두 번째 스캔을 수행하세요.
   참고: 채널을 순차적으로 수집하여 블리드 스루를 방지하세요.
8. 3D 재구성을 위해서는 적절한 샘플링을 위해 Z-스택 스텝 크기를 0.5 μm 이하로 설정하세요.
9. 메타데이터가 보존된 저장 파일.
10. 공동위치화 분석의 경우, 피어슨 상관계수를 계산할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어(예: 적합한 플러그인이 포함된 공개 소프트웨어)를 사용하세요.

6. 3차원 확률 광학 재구성 현미경(3D-STORM)을 통한 영상 촬영

1. STORM 이미징 버퍼²² 준비
   참고: 포도당 산화효소와 카탈라제를 영상 버퍼에 첨가하여 산소를 회수하여 광표백을 줄이고 STORM에서 단일 분자 위치 지정에 필수적인 형광체의 깜빡임 시간을 연장합니다.
   1. 포도당 산화효소(GOx) 스톡 용액을 8 mg/mL 용량의 50 mM 아세테이트 나트륨 완충제(pH 5.1)에 준비합니다.
   2. 160 μg/mL 1× PBS에 카탈라제 스톡 용액을 준비합니다.
      참고: 효소 스톡을 분리하여 액체 질소나 드라이아이스/에탄올 욕조로 급동한 후 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관하세요. 반복되는 냉동-해동 사이클은 피하세요.
   3. 빛으로부터 보호된 얼음 위에 신선한 STORM 영상 버퍼를 준비하세요.
   4. 최종 부피 1 mL에 따라 다음 성분들을 조합하세요: 멸균 무핵효소 H₂O (1 mL까지), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM 최종 부피), 1 M 트리스-HCl pH 8.0 (50 μL, 50 mM 최종 부피), 신선하게 준비된 1 M 시스티민(MEA, pH ~7.0 (50 μL, 50 mM 최종 용량), 50% (w/v) 포도당 (200 μL, 최종 10% w/v 최종 용액), GOx 스톡 (200 μL, 1.6 mg/mL 최종 용액), 카탈라제 용액 (200 μL, 최종 32 μg/mL).
   5. 피펫팅이나 역전으로 부드럽게 섞으세요. 소용돌이 하지 마세요.
      참고: 버퍼는 신선하게 준비되어야 하며, 빛으로부터 보호된 얼음 위에 보관해야 합니다. 준비 후 30분 이내에 사용하세요. STORM 영상 조건의 상세 최적화는 시험 샘플¹⁵를 사용한 확립된 프로토콜을 참조하십시오.
   6. 샘플을 완전히 덮기 위해 새로 준비한 STORM 이미징 버퍼 200 μL를 추가합니다.
2. 3D-STORM 시스템 구성
   1. 영상 경로가 전자 증폭 CCD(EMCCD) 카메라로 향하도록 하세요.
   2. 3D 이미징을 위해 원통형 렌즈 모듈을 작동시키세요.
   3. 소프트웨어를 3D STORM 획득 모드로 설정하세요.
   4. 사용되는 염료에 대해 광학 경로 필터를 설정하세요.
   5. 647 nm 레이저를 켜고 출력을 낮은 수준(1-5 mW)으로 설정하세요.
   6. 100× 오일 침지 대물렌즈(NA ≥1.4)를 사용해 광시야 또는 TIRF 라이브 미리보기 모드에서 관심 영역을 찾으세요.
   7. 나중에 비교하기 위해 일반적인 광시장 형광 이미지를 획득하세요.
   8. TIRF 조명 모드로 전환하세요.
   9. 배경 형광을 최소화하기 위해 TIRF 각도를 보정하여 희박한 조명장(~100-200 nm)을 달성합니다.
   10. 초기 신호 강도에 따라 카메라 노출 시간(10-30ms)을 조정하세요.
   11. 초기 신호 강도에 따라 영상 레이저 출력을 조정하세요.
   12. 간단한 테스트 획득을 수행하세요.
   13. 파라미터가 빠르게 표백되지 않고 올바르게 설정되었는지 확인하세요.
       참고: 원통형 렌즈 축이 샘플 평면과 정확히 일치하는지 확인하세요. 대부분의 현대 시스템은 자동 보정을 지원합니다. 수동 교정을 위해서는 100nm 형광 구슬을 사용하여 대칭적이고 둥근 점 확산 함수(PSF)를 검증합니다.
   14. 647 nm 레이저 출력(1–2 kW/^{cm ²})에서 10–30ms 노출로 시작한다.
   15. 깜빡임 밀도가 0.1–1 분자/^{μm 2}임을 확인하세요.
   16. 밀도가 너무 낮거나 높으면 레이저 출력이나 노출 시간을 조절하세요.
   17. 이상적인 밀도에 도달할 때까지 검증과 조정을 반복합니다.
3. 3D-STORM 데이터 수집
   1. 획득 소프트웨어를 "연속 활성화" 모드로 설정하세요.
   2. 영상 레이저(647 nm)를 고출력(100-500 mW 광섬유 입력)으로 설정하여 대부분의 형광체를 암흑 상태로 전환하세요.
   3. 활성화 레이저(405 nm)를 저출력(0.1–5 mW)으로 설정하세요.
   4. 405 nm 파워를 경험적으로 최적화하여 256×256 픽셀 영역에서 프레임당 100–200개의 국소 분자를 유지합니다.
   5. 총 프레임 수를 10,000–20,000으로 설정하세요.
   6. 활성화 빛 1프레임(405nm)을 사용한 후 5프레임의 영상광(647nm)을 사이클마다 사용하세요.
   7. 인수를 시작하세요.
   8. EMCCD를 최대 감도로 작동시키기 (EM 이득 적용)
   9. 프레임당 10–30ms 노출을 사용하세요.
   10. 획득 중에는 활성 분자 밀도를 모니터링하세요.
   11. 단일 분자 사건의 일정한 흐름을 유지하기 위해 405 nm 레이저 출력을 조정하세요.
       참고: 원시 영화 데이터는 복원 전에 장기 보관을 위해 표준 하드 드라이브에 저장할 수 있습니다.
4. 콜라겐 광물화 데이터 분석 (STORM 모듈과 함께 이미지 분석 소프트웨어를 사용)
   1. 분석 소프트웨어에서 적절한 카메라 드라이버(STORM 모듈)를 선택하세요.
   2. STORM 패널의 [분석 GUI] 를 클릭하세요. 분석 창이 열린다.
   3. [파일 열기]를 클릭하세요. 분석할 원시 현미경 이미지 파일을 선택하세요. 열기 버튼을 누르세요.
   4. 유효한 신호의 최소 형광 값(최소 높이)을 결정합니다.
   5. 가장 어두운 부분을 찾아내어 아직 단일 분자 신호로 인식됩니다.
   6. 마우스를 중앙으로 옮기세요.
   7. 최대 높이 값을 읽으세요.
   8. 이 값을 기록하세요.
   9. [식별 설정]을 클릭하세요. 대화 상자에서 다음 매개변수를 설정하세요: 최소 높이(6.4.8단계에서 기록된 값을 입력), 최대 높이(20000), CCD 기준선(100), 그리고 3D-STORM 데이터의 경우 "3D"를 체크하고(2D는 체크 해제).
   10. >> 클릭하면 더 많은 매개변수를 확장할 수 있습니다. 설정: 최소 폭(nm)을 200으로, 최대 너비(nm)를 700으로 (2D는 400), 초기 맞춤 폭(nm)은 300, 최대 축방향 비율은 2.5(2D는 1.3), 최대 변위(픽스)는 1입니다.
   11. 확인을 클릭하여 대화상자를 닫으세요.
   12. 매개변수를 검증하기 위해 테스트 분석을 수행하세요. 드리프트 보정 체크 해제.
   13. 주기를 1로 설정하세요.
   14. [테스트]를 클릭하세요.
   15. 분석 후 팝업 대화상자에서 확인(OK)을 클릭하세요.
   16. 신호 지점이 정확히 식별되었는지 확인하세요. 배경 소음은 잘못 선택해서는 안 됩니다. 진짜 지점은 놓치면 안 됩니다.
   17. 만족스럽지 않으면 6.4.9–6.4.16 단계를 반복하여 파라미터를 조정하여 올바른 결과가 나올 때까지 조정합니다.
   18. 테스트 분석이 통과되면 전체 분석을 수행하세요. 드리프트 보정을 확인하세요.
       참고: 분석 소프트웨어는 분자 국소화 시간분 간 상관관계를 극대화하는 중복 교차상관(RCC) 알고리즘을 사용하여 드리프트 보정을 수행합니다. 피듀얼 비즈는 필요 없다²³.
   19. 주기 유지 = 1.
   20. [시작]을 클릭하세요(또는 [테스트]를 다시 클릭한 후 [시작]).
   21. 분석이 완료될 때까지 기다려. 팝업 대화상자에서 확인을 클릭하세요.
   22. 분석 후, 두 개의 결과 파일(.bin과 .txt)이 .nd2 파일과 같은 폴더에 생성됩니다.
   23. 공동 위치 분석(647 nm 및 488 nm 채널)의 경우, 분석 창의 채널 목록에 두 채널을 동시에 표시하세요.
   24. 적절한 관심 영역(ROI)을 선택하세요.
   25. 코로컬라이제이션 모듈을 사용해 피어슨 상관계수를 계산하세요. 자동 제공되지 않은 경우, 공개된 이미지 분석 소프트웨어의 공동로컬라이제이션 플러그인으로 포인트 클라우드 데이터를 수동으로 내보내세요. 가치를 기록하세요.
   26. 섬유내 광화를 확인하기 위해 Z-슬라이스 분석을 수행하세요. 메인 메뉴에서 Z-스테핑 > 슬라이스> 보기를 선택하세요.
   27. 60 nm 간격으로 개별 평면을 추출합니다.
   28. 광물 신호를 관찰하세요 (초록색, 488nm 채널). 신호가 중앙 슬라이스(Z = 0 nm ±120 nm)에 남아 있는지 확인하세요. 지속 검사는 섬유내 광물화를 확인한다.
   29. 선택적으로: 밀도 필터링을 수행하여 밀집된 방출기로 인한 과도한 계산을 줄입니다. 단일 분자 위치 분석 플러그인을 사용해 공개된 이미지 분석 소프트웨어에서 STORM 재구성 이미지를 열어²⁴.
   30. 밀집된 방출기에서 과도한 수치를 줄이기 위해 신호 밀도에 따라 밀도 필터링(예: 중앙값 필터 또는 국소 밀도 임계값)을 적용합니다.
   31. 6.4.18 단계에서 드리프트 보정이 활성화되지 않았거나 추가 보정이 필요한 경우, 드리프트 보정을 수행합니다. 수탁자 기준 PSF에 근거한 수정입니다. 또는 교차상관 알고리즘(예: 동일 플러그인에서 구현된 드리프트 보정)을 사용할 수 있습니다.
   32. 채널 크로스토킹을 제거하기 위해 스펙트럼 혼합을 수행합니다. STORM 분석 창에서 보통 오른쪽 하단에 있는 교차 제거 도구를 클릭하세요.
   33. 반경을 25.0 nm로 설정하세요(권장). 소스 채널을 선택하세요. 제거 방법을 선택하세요: 통계적 방법을 권장합니다.
   34. 여기 레이저로 인한 교차 활성화를 제거하려면 교차 활성화 > 함께 빼기(Subtract)를 선택하세요. 확인 버튼을 누르세요. 새로운 채널인 Nonspecific Activation-Xt가 자동으로 생성됩니다.
   35. 염색되지 않은 대조군 샘플을 사용하여 자가형광 수준과 배경 신호를 검증합니다. 모든 신호에 구체적으로 라벨이 붙어 있는지 확인하세요.
   36. 3D 시각화를 수행하세요. 분석 창에서 관심 영역(ROI)을 선택하세요.
   37. [3D] 버튼(또는 [3D 표시])을 클릭하세요. 3D 프로젝션 또는 볼륨 렌더링을 생성하세요.
   38. 오른쪽 클릭으로 렌더링 매개변수를 조정하세요. 일반적인 형식(예: .avi 또는 .mp4)으로 비디오를 내보내세요.
   39. 광물 신호를 섬유 내로 분류하려면 6.4.26–6.4.28과 같이 Z-슬라이스 분석을 수행하세요. 강도 프로필을 내보내세요.
   40. 섬유 중심을 콜라겐 신호가 최대 크기인 Z-평면으로 정의하자.
   41. 광물 신호가 Z = 0(중심)과 Z = ±60 nm에서의 강도가 해당 섬유 내 최대 광물 강도의 ≥50%일 때 섬유 내로 간주됩니다. 신호가 Z = 0에서 30% 이하로 떨어지면 섬유외 섬유로 분류됩니다.
   42. 각 조건당 최소 50개의 섬유에 대해 분류를 기록하여 섬유 내 광물화 비율을 계산합니다.
       참고: 밀도 필터링, 드리프트 보정, 스펙트럼 언믹싱을 위한 대체 공개 플러그인도 제공됩니다.

Results

이 프로토콜의 성공적인 구현으로 다색 3D-STORM을 이용한 광화 콜라겐 섬유의 고해상도 3차원 시각화가 가능해졌습니다. 다음 결과는 일반적인 결과, 품질 관리 및 정량적 평가를 보여줍니다.

그림 1 은 비정질 인산칼슘(ACP)으로 광화된 콜라겐 네트워크를 다색 3D-STORM 재구성한 모습을 보여줍니다. 콜라겐(원적색 형광 염료로 표지됨)은 잘 정의된 섬유 네트워크로 나타납니다. 콘드로이틴 황산염(GAG, 붉은 염료로 표기됨)은 콜라겐 섬유와 밀접하게 연관되어 있으며, 병합된 이미지에서 공존 위치가 청록색으로 나타납니다. 중요하게도, ACP 입자(녹색, 칼슘 지표 염료로 표기됨)는 콜라겐 섬유 경계 내에서 관찰되며, 초기 단계(30분)에 섬유 내 광화가 나타납니다. 이 그림은 프로토콜이 콜라겐, GAG, 미네랄 등 세 가지 서로 다른 성분을 나노 스케일에서 동시에...

Discussion

이 프로토콜은 다색 3D-STORM을 이용한 콜라겐 광물화의 나노스케일 시각화를 위한 포괄적인 워크플로우를 제공합니다. 성공적인 결과를 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계에 특별한 주의가 필요합니다.

첫째, 샘플 준비는 고품질 STORM 영상의 기초입니다. 유리 바닥 접시의 아미노-실란화는 세척 및 라벨링 과정에서 콜라겐 섬유가 안정적으로 부착되도록 철저해야 합니다. 잔류 APTES는 비특이적 결합과 높은 배경 결합을 유발할 수 있으며, 불완전한 실란화는 섬유 박리를 초래할 수 있습니다. 권장되는 초음파 단계(40kHz에서 10분)는 표면 기능성을 유지하면서 결합되지 않은 실란을 효과적으로 제거합니다. 콜라겐 섬유 가교 연결에는 고특이성을 위해 EDC/NHS²¹ 이 권장됩니다. 또는 0.1% 글루타알데히드를 사용할 수 있는데(상온에서 30분간 배양한 후 철저히 세척), 특이성은...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
폴리아스파르트산 (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	비정질 칼슘 인산염 안정화제
칼슘 염화물 (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	칼슘 공급원
이나트륨 인산염 (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	인산염 공급원
나트륨 염화물 (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	이온 강도 조절제
폴리아크릴산 (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	고농도 칼슘 안정화제
트리스 기본	Sigma-Aldrich	T1503	버퍼 구성 요소
나트륨 아지드 (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	항균제
(3-아미노프로필)트리에톡시실란 (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	유리 표면 기능화 제
절대 에탄올	Sigma-Aldrich	459836	용매
I 유형 콜라겐 용액 (0.1 M 아세트산에 50 μg/mL)	Corning	354249	자가 조립 스캐폴드
콘드로이틴 설페이트 (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	비콜라겐 단백질 모방
EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)	Sigma-Aldrich	E7750	교차 연결제
NHS (N-하이드록시 석시네이미드)	Sigma-Aldrich	130672	교차 연결 활성제
MES 자유 산	Sigma-Aldrich	M5287	교차 연결 버퍼
인산염 완충 생리 용액 (PBS)	Gibco	10010023	세척 및 희석 버퍼
우 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	차단제
토끼 항-콜라겐-I 항체	Abcam	ab34710	콜라겐 1차 항체
마우스 항-콘드로이틴 설페이트 항체	Sigma-Aldrich	C8035	CS 1차 항체
원적외선 형광 염료 (알렉사 플루오르 647)로 결합된 토끼 항-면역글로불린 G	Thermo Fisher Scientific	A-21244	콜라겐 2차 항체
빨간색 형광 염료 (알렉사 플루오르 568)로 결합된 염소 항-마우스 IgM	Thermo Fisher Scientific	A-11031	CS 2차 항체
칼세인 (칼슘 지시자 염료)	Sigma-Aldrich	C0875	칼슘 인산염 표지
트윈-20	Sigma-Aldrich	P1379	세척 버퍼 용 세정제
글리세롤	Sigma-Aldrich	G5516	이미징 버퍼 구성 요소
글루코오시다제 (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	산소 소거제
카탈라아제	Sigma-Aldrich	C1345	산소 소거제
시스테아민 (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	형광단 깜빡임용 티올
D-글루코오스	Sigma-Aldrich	G6152	글루코오시다제 기질
나트륨 아세테이트	Sigma-Aldrich	S2889	GOx 스톡 버퍼
염산 (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	pH 조절
수산화 나트륨 (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	pH 조절
포스포텅스틱 산	Sigma-Aldrich	P4006	TEM 용 음성 염색
유리 바닥 배양 접시 (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	시료 기판; 두께 0.17 mm
초음파 세정기 (40 kHz)	Branson	B200	세척 장치
습도 챔버	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	콜라겐 자가 조립용
투과 전자 현미경	Hitachi	HT7800	TEM 이미징
폼바/탄소 코팅 TEM 격자 (200 메쉬)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	TEM 시료 지지
수평 셰이커 플랫폼	Labnet	S2030-RC	부드러운 세척
공초점 레이저 스캐닝 현미경	Nikon	A1	예비 스크리닝
3D-STORM 현미경 시스템 (405/488/647 nm 레이저, 원통형 렌즈, EMCCD)	Nikon	N-STORM	초고해상도 이미징
100배 유몰입 객체렌즈 (NA 1.49)