Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray
March 20th, 2009
Het cDNA microarray PtGen2 is ontwikkeld voor genexpressie studies in loblolly pine, P. taeda, En andere naaldbomen. Hier tonen we pre-en post-hybridisatie hanteren en wassen technieken die gebruikt kunnen worden met deze array betere consistentie, verminderde artefacten, en een lagere opbrengst achtergronden.
Deze video is gemaakt door onderzoekers van de Warnell School of Forestry and Natural Resources van de University of Georgia. Het doel van deze trainingsvideo is om uit te leggen hoe we onze LOB lolly pine pt, gen two CDNA, microarray verwerken, met bijzondere aandacht voor het wassen en hanteren van de array, zowel voor als na hybridisatie. In het algemeen volgen onze protocollen die ontwikkeld zijn bij het Institute for Genomic Research Tiger en de Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, waar onze arrays worden afgedrukt.
We hebben geconstateerd dat een strengere verwerking van PT Gen two vereist is om de grootste hoeveelheid consistentie te bieden met betrekking tot de uniformiteit van de signaalkwaliteit en lage achtergronden. De eerste stap is een voorwas. We doen dit omdat onze spotting buffer een zeer hoog zoutgehalte bevat en deze voorwas noodzakelijk is om dat zout te verwijderen.
De slides worden geplaatst in een microscoopglashouder en krachtig 15 tot 20 keer in een 0,2%SDS-oplossing gedompeld die voorverwarmd is tot 43 graden. Nadat de slides in de SDS-oplossing zijn gewassen, worden ze voorzichtig verwijderd met pincetten in een Copeland-pot met prehybridisatie buffer. Deze buffer bevat vijf XSSC 0,1%SDS en 1%BSA, en wordt ook verwarmd op 43 graden.
De Copeland-pot wordt bedekt met parfum en gedurende een uur in een incubator van 43 graden geplaatst. Na de prehybridisatie worden de slides verwijderd naar een microscoopglashouder en opeenvolgend verwerkt door vijf veranderingen van gedeïoniseerd water, 15 tot 20 keer in elke verandering. Ten slotte worden de slides in isopropanol geplaatst en vijf of zes keer gedompeld voordat ze worden gecentrifugeerd tot droogheid in een chip M mate centrifuge.
Na het centrifugeren worden de slides geblazen met perslucht die door een 0,2 micron filter is gepasseerd. De slides worden vervolgens bedekt met lifter slips, die ook met perslucht zijn schoongemaakt, en we gebruiken een kleine pipettentip om de lifter slip in de juiste positie aan te passen. Op de slide.
Nadat de lifter slips zijn gepositioneerd, maar voordat de hybridisatie buffer wordt toegevoegd, voegen we 20 microliter van 100 millimolar dihi, drie atol toe aan de vochtigheidsputten die zich aan de uiteinden van de kamer bevinden. Nu zijn we klaar om de doel-CDNA's toe te voegen, die zijn opgeschort in hybridisatie buffer. De pipettentip wordt geplaatst aan de rand van de lifter slip en de slide en de oplossing wordt langzaam gepipetteerd.
We hebben gevonden dat het gebruik van het capillaire effect om de arrays te laden de meeste consistentie biedt en de opname van ongewenste bubbels aanzienlijk vermindert. Nadat het doelmateriaal aan de array is toegevoegd, wordt de hybridisatiekamer geassembleerd en bedekt met aluminiumfolie. De hybridisatiekamer wordt vervolgens in een schuddend waterbad geplaatst voor overnachtelijke incubatie, typisch 14 tot 16 uur.
Het waterbad wordt ingesteld op 48 graden en de schudder wordt ingesteld op 50 tpm. Het is ook belangrijk om op te merken dat vanaf het punt van toevoeging van de hybridisatieoplossing tot alle post-hybridisatie wasbeurten, de procedures worden uitgevoerd in laag licht om foto-oxidatie te voorkomen. De volgende dag worden de slides uit het hybridisatiekamer verwijderd en in een Copeland-pot met wasoplossing nummer één geplaatst, die voorverwarmd is tot 53 graden.
De slides worden ongeveer een minuut in de Copeland-pot geplaatst tot de lifter slips wegvallen, waarna de slides voorzichtig met pincetten worden verwijderd en in een microscoopglashouder worden geplaatst om met de wasbeurten door te gaan. De slides worden vervolgens krachtig ongeveer 15 tot 20 keer in een tweede container gedompeld, die ook wasoplossing nummer één bevat bij 53 graden. De container wordt vervolgens bedekt met parfum en in een incubator luchtschudden geplaatst ingesteld op 53 graden en honderd RPM.
Na de 10 minuten incubatie en wasoplossing, nummer één, worden de slides krachtig 15 tot 20 keer gedompeld in een container met wasoplossing nummer twee, die op kamertemperatuur is. De container is bedekt met parafilm en weer op een shaker geplaatst bij kamertemperatuur voor een incubatie van 10 minuten. Ten slotte worden de slides uit wasoplossing nummer twee verwijderd en krachtig 15 tot 20 keer gedompeld in een container met wasoplossing nummer drie.
De slides worden vervolgens in een tweede container met wasoplossing nummer drie geplaatst, bedekt met perfil en weer op de shaker geplaatst voor 10 minuten. Na de laatste was worden de slides gecentrifugeerd tot volledige droogheid. Om dit te doen, plaatsen we een 15 mil Falcon-dop in een 50 mil conische buis, en plaatsen we de arrays met de barcode naar beneden in de conische buis.
De buizen worden vervolgens gedraaid in een draaiende emmerkop bij 1500 tpm bij kamertemperatuur. Na centrifugatie worden de slides verwijderd naar een tweede set van 50 mil conische buizen, die zijn bedekt met aluminiumfolie. De buizen worden vervolgens ontdaan van stikstofgas, dat is gefilterd door een 0,22 micron filter en dop voor transport of voor opslag tot scannen.
We verzamelen scangegevens op een PerkinElmer scan array 5.000. Het arraybeeld is geruit en ruwe scangegevens worden verwerkt en initiële gegevensanalyse wordt uitgevoerd met Bio Discovery's imaging software suite. Vervolgens worden de spot signaal intensiteit gegevens genormaliseerd terwijl statistische analyses worden uitgevoerd met BRB array tools, een robuust en vrij beschikbaar microarray statistisch pakket dat kan worden gedownload van het National Cancer Institute.
Andere statistische analyses en zoekopdrachten naar genexpressiepatronen worden uitgevoerd met de gene expressie patroon en analyse suite Jeep PPAs. Nog een vrij beschikbaar web-gebaseerde analyse pakket. Bedankt voor het bekijken van onze video over het verwerken van de lob lolly pine PT Gen two microarray.
De volgende personen waren verantwoordelijk voor de inhoud en productie van deze trainingsvideo.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert de cDNA microarray PtGen2 die is ontwikkeld voor genexpressiestudies in loblolly-den en andere coniferensoorten. Het beschrijft de pre- en post-hybridisatiebehandeling en wastechnieken om consistentie te verbeteren en artefacten te verminderen.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Genexpressieanalyse
- Microarraytechnologie
- Plantkunde
Achtergrond
- CDNA-microarrays zijn essentieel voor het bestuderen van genexpressie.
- PtGen2 is specifiek ontworpen voor loblolly-den en coniferen.
- Juiste behandelingstechnieken zijn cruciaal voor betrouwbare resultaten.
- Hoog zoutgehalte in spottingbuffer vereist pre-washing.
Doel van het onderzoek
- Om de consistentie van genexpressiegegevens te verbeteren.
- Om achtergrondruis in microarrayresultaten te verminderen.
- Om een gestandaardiseerd protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Pre-wash om zout uit de spottingbuffer te verwijderen.
- Strenge wastechnieken na hybridisatie.
- Vergelijking met protocollen van gevestigde onderzoeksfaciliteiten.
- Evaluatie van signaalkwaliteit en achtergrondniveaus.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde consistentie in signaalkwaliteit waargenomen.
- Lagere achtergrondniveaus bereikt met verfijnde technieken.
- Protocollen toonden effectiviteit in meerdere experimenten.
- Aanbevelingen voor toekomstig onderzoek gegeven.
Conclusies
- Verbeterde behandelings- en wastechnieken zijn essentieel voor microarraysucces.
- Gestandardiseerd protocollen kunnen leiden tot betrouwbaardere genexpressiegegevens.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen voor betere resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key challenge in plant genomics: achieving reproducible microarray data despite high-salt spotting buffers that can introduce artifacts. By standardizing pre- and post-hybridization washing steps, the method enhances data consistency and reduces background noise, supporting reliable gene expression profiling in conifer species. This contributes to target validation efforts in forestry biotechnology by enabling clearer detection of differentially expressed genes under experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses in conifer tissues, supporting hypothesis testing in stress or developmental pathways.
- Operational Value: Reduces technical variability from salt artifacts, improving confidence in target identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, low-background microarray slides suitable for reproducible hybridization across experimental groups.
- Operational Value: Establishes a robust slide preparation workflow that enhances assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by providing reliable expression profiles from pine tissues, useful in studying environmental adaptation or wood formation.
- Operational Value: Facilitates cross-study comparability through consistent slide processing, aiding translational continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology workflow, specifically supporting reliable target profiling in non-model plant systems where genetic tools are limited.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven expression analysis in loblolly pine, clarifying gene responses in root, needle, and stem tissues.
- Screening: Delivers microarray slides with uniform signal quality, enabling reliable comparative screening of gene expression under varying conditions.
- Analytics: Generates clean, normalized signal intensity data compatible with downstream tools like BRB Array Tools and JePPAs for statistical analysis.
- Translational Research: Supports continuity from gene discovery to functional validation by providing trustworthy expression baselines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable slide preparation protocol that can be applied across multiple conifer species and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in gene expression measurements by minimizing salt- and SDS-derived artifacts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across slides and laboratories through defined washing and handling steps.
- Strategic Value: Reduces risk of false positives/negatives in expression profiling, supporting better go/no-go decisions in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate genes based on cleaner, more reliable expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray handling and hybridization techniques.
- Needs access to temperature-controlled water baths, incubators, and centrifuges for slide processing.
- Demands standardized reagents including SDS, SSC, BSA, and isopropanol for washing and dehydration.
- Requires adaptation of humidity control and hybridization timing based on target RNA source and labeling method.
- Practical limitation: High-salt spotting buffer necessitates rigorous pre-washing; incomplete salt removal may persist if steps are shortened.
