Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

Het algemene doel van dit methodenartikel is om de gedetailleerde protocollen te introduceren die door ons laboratorium worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire herkenning van dubbelstrengs RNA's door chemisch gemodificeerde peptide nucleïnezuren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van RNA chemische biologie, zoals detectie en targeting van RNA structuren. Het grote voordeel van deze techniek is dat de ontwerpprincipes toepasbaar kunnen zijn op het targeten van elke RNA-duplex structuur.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Desiree Toh, een onderzoeksmedewerker uit mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, voeg je vier microliter van een 35% glyceroloplossing toe aan eerder bereide RNA PNA-monsters en meng je voorzichtig. Gebruik een micropipet en gel-loading tips om voorzichtig 20 microliter van elk monster in een eerder bereid polyacrylamidegel te doen en zorg ervoor dat je geen luchtbellen introduceert.

Laat de gel vijf uur lang draaien op een constante spanning van 250 volt. Na vijf uur zet je de stroomtoevoer uit en verwijder je de glazen plaat uit de gelstandaard. Verwijder vervolgens de gelverzegeling en haal de glazen plaat uit elkaar.

Verwijder voorzichtig de gel van de glazen plaat en plaats hem in een container gevuld met 350 milliliter gedeïoniseerd water. Voeg voorzichtig 35 microliter etidiumbromide toe aan de container en plaats deze op de platform shaker op lage snelheid gedurende 30 minuten. Na het weggooien van de etidiumbromideoplossing, spoel je de gel met 1,5 tot twee liter gedistilleerd water.

Scan vervolgens de gel met een imager met een groene laser van 532 nanometer en de emissiefilter ingesteld op 610 nanometer. Kwantificeer de gelbandintensiteiten met behulp van gratis software. Breng de juiste hoeveelheid 2-aminopurine gelabeld dubbelstrengs RNA over in een schone 1,5 milliliter buis.

Concentreer vervolgens de RNA-oplossingen met behulp van een vacuüm concentrator. Breng vervolgens de juiste volumes van de getargetteerde PNA voor verschillende concentraties over vanaf de eerder bereide hoofdstock naar afzonderlijke 1,5 milliliter buizen. Concentreer de PNA-oplossingen met behulp van de vacuüm concentrator.

Voeg 975 microliter incubatiebuffer toe aan de buis met het gedroogde RNA en meng grondig om ervoor te zorgen dat al het RNA is opgelost. Na kort centrifugeren van de RNA-oplossing, onderwerp je deze aan annealing door de buis 10 minuten in een voorverwarmde hitteblok te plaatsen. Als je klaar bent, zet je de hitteblok uit en laat je het monster afkoelen tot kamertemperatuur.

Voeg 75 microliter RNA toe aan elk van de buizen met het gedroogd PNA en meng grondig. Laat de monsters minimaal een uur op kamertemperatuur staan, en incubeer ze daarna een nacht bij vier graden Celsius. Breng nu de juiste hoeveelheden 2-aminopurine gelabeld enkelstrengs RNA over naar afzonderlijke 1,5 milliliter buizen.

Breng de juiste volumes van de getargetteerde PNA voor verschillende concentraties over vanaf de hoofdstock naar de respectieve buizen met het enkelstrengs RNA. Nadat je de monsters hebt gedroogd, voeg je 75 microliter incubatiebuffer toe aan elk van de buizen en meng grondig. Onderwerp elk monster aan annealing door elk buisje 10 minuten in een voorverwarmde hitteblok te plaatsen.

Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en incubeer ze daarna een nacht bij vier graden Celsius. Breng vervolgens 70 microliter van elk monster over in een vierkante cuvet van één centimeter. Plaats de cuvet in een fluorescentiespectrofotometer en meet de emissie over het golflengtebereik van 330 tot 550 nanometer.

Zodra de meting voltooid is, verwijder je de buffer uit de cuvet. Spoel de cuvet af met gedistilleerd water en droog af met stikstofgas. Na het herhalen van de meting voor alle monsters, plot je de fluorescentie-intensiteit tegen de golflengte.

Breng de juiste hoeveelheden enkelstrengs RNA over naar afzonderlijke 1,5 milliliter buizen. Breng vervolgens de juiste volumes van de getargetteerde PNA over vanaf de hoofdstock naar de respectieve buizen met het enkelstrengs RNA. Nadat je de monsters hebt gedroogd, voeg je 130 microliter incubatiebuffer toe aan elk van de buizen en meng grondig.

Onderwerp elk monster aan annealing door elk buisje 10 minuten in een voorverwarmde hitteblok te plaatsen. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur en incubeer ze daarna een nacht bij vier graden Celsius. Breng nu 130 microliter van elk monster over naar een acht-cel cuvet met één cel die incubatiebuffer bevat.

Meet de absorptie van elk monster bij 260 nanometer met behulp van een UV-Vis spectrofotometer. Meet bij toenemende temperatuur van 15 tot 95 graden Celsius gevolgd door afnemende temperatuur van 95 tot 15 graden Celsius bij een ramp snelheid van 0,5 graden Celsius per minuut. PNA oligomeren werden verkregen na twee omgekeerde fase HPLC-zuiveringen.

De identiteit van de PNAs kan worden bevestigd door MALDI/TOF-analyse. De non-denaturing PAGE-gegevens suggereren dat de Q en L gemodificeerde PNA alleen de dubbelstrengs RNA-regio met een C-G paar kan herkennen. Deze specifieke en verbeterde herkenning vindt plaats door de T-A-U-L-G-C en de Q-C-G PNA RNA twee basen triple formatie.

Een 2-aminopurine fluorescentie titratiestudie toonde aan dat een Q en L gemodificeerde PNA bindt aan een getargetteerde dubbelstrengs RNA maar niet aan enkelstrengs RNA. PNAs die Q residuen bevatten, vertonen geen thermische smeltovergangen, wat wijst op een afwezigheid van binding aan enkelstrengs RNA vanwege de sterieke botsing in het Watson Watson-Crick-achtige Q-G paar. In vergelijking met ongemodificeerde PNA P1, tonen PNAs P4 en P5 die L residuen bevatten, een lagere smelttemperatuur voor de corresponderende RNA PNA-duplexen vanwege de sterieke botsing in het Watson-Crick-achtige L-G paar.

De UV-absorptie gedetecteerde thermische smeltgegevens zijn consistent met de 2-aminopurine fluorescentie titratiegegevens, die ook aantonen dat een PNA met Q en L residuen niet ster