Wielokolorowy protokół wizualizacji wysokiej rozdzielczości 3D-STORM do mineralizacji kolagenu w samouzbrajacyh się rekombinowanych fibrilach kolagenu typu I

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół do rozróżnienia mineralizacji wewnątrzfibrylarnej i pozafibrylarnej w rekombinowanych fibrilach kolagenu za pomocą wielokolorowej 3D‑STORM, integrującej zoptymalizowane oznakowanie, obrazowanie i ilościową analizę kolokalizacji.

Abstract

Ten protokół opisuje wielokolorową, trójwymiarową metodę stochastycznej mikroskopii optycznej rekonstrukcyjnej (3D-STORM) do nanoskalowej wizualizacji mineralizacji kolagenu w modelu samouzbrajanych fibril kolagenu typu I. Metoda ta umożliwia jednoczesne obrazowanie kolagenu, białek niekolagenowych (np. siarcinian chondroityny) i faz mineralnych fosforanów wapnia. Przygotowanie próbki obejmuje aminosilanizację i samouzbrajanie kolagenu, a następnie mineralizację za pomocą medium fosforanów wapnia, które w wczesnym etapie (30 min) tworzy amorficzny fosforan wapnia (ACP) i dojrzewa do hydroksyapatytu (HAP) po 6 godzinach. Następnie przeprowadza się wielokolorowe znakowanie immunofluorescencyjne, a próbki są najpierw badane za pomocą mikroskopii konfokalnej przed pozyskaniem obrazu 3D-STORM przy użyciu bufora do obrazowania odtlenającego tlen. Przetwarzanie i analiza danych są przeprowadzane za pomocą publicznie dostępnego oprogramowania. W porównaniu z konwencjonalną mikroskopia elektronowa lub konfokalna, ten protokół łączy specyficzność molekularną z nanoskalowa rozdzielczością (typowa precyzja boczna 20–30 nm, oś 50–60 nm), umożliwiając trójwymiarową wizualizację wzorców mineralizacji wewnątrzfibrylarnych i pozafibrylarnych. Wyniki reprezentatywne pokazują jasne wizualizacje sieci kolagenu, związanych białek niekolagenowych i faz mineralnych w przestrzeni trójwymiarowej. Ilościowe wskaźniki, w tym współczynnik korelacji Pearsona (0,89 ± 0,04) i współczynnik nakładania się Mandersa (0,91 ± 0,03) są podane w sekcji Wyniki. Ten protokół oferuje potężne narzędzie dla naukowców z dziedziny nauki o biomateriałach, biomineralizacji i inżynierii tkankowej kości, którzy wymagają nanoskalowych informacji na temat dynamiki mineralizacji.

Introduction

Mineralizacja kolagenu to fundamentalny proces biologiczny, który odgrywa kluczową rolę w tworzeniu twardych tkanek, takich jak kości i zęby¹. Złożona struktura włókien kolagenu, w połączeniu z precyzyjnie ustawioną regulacją osadzania minerałów, nadaje tym tkankom niezwykłą wytrzymałość mechaniczną i integralność strukturalną². Kolagen pełni rolę nie tylko biernego szkieletu, ale także aktywnego uczestnika, koordynując precyzyjne osadzanie minerałów poprzez złożone interakcje molekularne i fizyczne³. Rozjaśnienie tych mechanizmów jest kluczowe dla zrozumienia chorób takich jak osteoporoza i próchnica oraz dla opracowywania materiałów biomimetycznych do terapii regeneracyjnych⁴.

Średnica włókien kolagenu w tkankach twardych waha się od około 50 do 100 nm, przy czym cząstki hydroksyapatytu (HAP) są jeszcze mniejsze (zwykle 2–5 nm grubości i 20–30 nm długości) i są splecione w przestrzeniach fibrylarnych⁵. Podczas gdy strefy szczelin mogą służyć jako miejsca nukleacji, w naturalnych tkankach minerały początkowo tworzą się w przestrzeniach interfibrylarnych, a następnie rozprzestrzeniają się do przestrzeni intrafibrilarnych. Tradycyjne metody charakteryzacji obejmują barwienie histologiczne, konfokalną mikroskopię laserową^6,7 oraz mikroskopię elektronową^8,9. Barwienie histologiczne zapewnia makroskopowe ocena, ale nie może oceniać stanów mineralizacji w skali nanometrowej. Mikroskopia konfokalna umożliwia obserwację określonych komponentów, ale jest ograniczona dyfrakcją (około 200 nm w pionie), nie jest w stanie rozróżnić mineralizacji intrafibrilarnej i extrafibrilarnej¹⁰. Mikroskopia elektronowa oferuje wysoką rozdzielczość, ale brakuje jej specyficzności molekularnej. Chociaż znaczenie immunogoldowe może zapewnić specyficzność molekularną dla mikroskopii elektronowej, wymaga specjalistycznej obróbki i jest mniej przystosowana do wielokanałowej, trójwymiarowej wizualizacji wielu komponentów w porównaniu ze STORM, a także wiąże się z długimi cyklami eksperymentalnymi i wysokimi kosztami¹¹.

Stochastyczna optyczna rekonstrukcja mikroskopowa (STORM) pozwala przekroczyć limit dyfrakcji poprzez lokalizowanie pojedynczych fluoroforów z wysoką precyzją, osiągającą rozdzielczość boczną około 20 nm¹². W porównaniu z innymi technikami superrozdzielczości, takimi jak mikroskopowa deplecja emisji stymulowanej (STED)¹³ i mikroskopowa iluminacja strukturalna (SIM)¹⁴, STORM oferuje wyższą precyzję lokalizacji (około 20 nm bocznie i około 50 nm wzdłużnie) i jest kompatybilna z szerokim zakresem organicznych fluoroforów. W szczególności STED wymaga specjalistycznych barwników i wysokich mocy laserów, które mogą uszkodzić próbki biologiczne, podczas gdy SIM oferuje tylko rozdzielczość około 100 nm, co jest niewystarczające do rozróżnienia cech w skali fibryli (50–100 nm). STORM zapewnia praktyczną równowagę między rozdzielczością, zdolnością do wielokanałowości a kompatybilnością próbki. Opublikowane wytyczne opisują zstandaryzowane próbki testowe, które ułatwiają optymalizację parametrów obrazu STORM i ocenę rozdzielczości¹⁵. W połączeniu z trójwymiarowymi możliwościami obrazowania, 3D-STORM umożliwia nanoskalową wizualizację wielu komponentów jednocześnie¹⁶. Ostatnie postępy rozszerzyły STORM na wielokolorowe i wielokanałowe obrazy, umożliwiając wizualizację wielu celów w tej samej próbce^17,18.

Niniejszy protokół wykorzystuje biomimetyczny model in vitro oparty na samozbierających się rekombinowanych włóknach kolagenu typu I i jest ściśle zaprojektowany dla in vitro modeli samozbierających się włókien kolagenu typu I w celu rozróżnienia mineralizacji intrafibrilarnej i extrafibrilarnej w skali nanometrowej. Nie nadaje się do obrazowania żywych komórek, ponieważ STORM wymaga utrwalonych próbek i buforów usuwających tlen. Nie nadaje się również do naturalnie wysoce zmineralizowanych tkanek (np. dojrzałej kości) bez wcześniejszego odwapniania lub odzysku antygenu. Jeśli wymagana jest tylko ocena ogólnej gęstości minerałów lub dużej morfologii obszaru, konwencjonalna mikroskopia konfokalna lub elektronowa jest bardziej skuteczna.

Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego, stopniowego przepływu pracy dla wykorzystania wielokolorowej 3D-STORM do wizualizacji nanoskalowej dystrybucji minerałów i białek niekolagenowych wewnątrz pojedynczych włókien kolagenu, ze szczególnym naciskiem na rozróżnienie mineralizacji intrafibrilarnej i extrafibrilarnej. Ten protokół integruje zoptymalizowane immunolabeling z dostosowanym buforem obrazu, aby umożliwić jednoczesne śledzenie wielu organicznych komponentów (kolagen, białka niekolagenowe) i faz nieorganicznych (ACP, HAP) w trzech wymiarach¹⁹. Kluczow

Protocol

Wszystkie eksperymenty z użyciem próbek biologicznych przeprowadzano zgodnie z wytycznymi i regulacjami Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine i zostały zatwierdzone przez Komitet Biobezpieczeństwa Instytucjonalnego (Certyfikat zatwierdzenia nr. BSL20235710079). Opisany tutaj protokół eksperymentalny wykorzystuje komercyjnie dostępne reagenty i układy biomimetyczne in vitro. Nie obejmuje on udziału ludzkich uczestników, zwierząt doświadczalnych ani ludzkich próbek tkankowych, a zatem nie wymaga zatwierdzenia etycznego przez instytucjonalny komitet rewizyjny.

UWAGA: Wszystkie procedury związane z niebezpiecznymi chemikaliami muszą być wykonywane w komorze wentylacyjnej z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice, gogle ochronne). Odpady chemiczne należy wyrzucać zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi. W przypadku NaN₃ należy zbierać odpady w dedykowanym pojemniku oznaczonym jako “odpady z azydami” i nie mieszać z kwasami (ryzyko eksplozji gazu). W przypadku glutaraldehydu, inaktywować za pomocą 10% nadmiaru bisulfitu sodu przed wyrzuceniem. W przypadku β-merkaptoetanol, utlenić za pomocą wybielacza (1:10 v/v) przez 1 godzinę przed zalaniem ściekami.

UWAGA: Barwienie immunofluorescencyjne MUSI być przeprowadzone PRZED mineralizacją, aby uniknąć maskowania epitopów przez osady mineralne. W przypadku zastosowań wymagających barwienia po mineralizacji, może być konieczna reaktywacja antygenu.

1. Przygotowanie pożywki do mineralizacji

1. Przygotowanie pożywki do mineralizacji dla zrekonstruowanych fibrili kolagenu
   1. Przygotuj roztwór wapniowy przez dodanie 100 μL 5 mg/mL kwasu poliasparaginowego (p-Asp, Mw 9-11 kDa) kroplowo do 5 mL 3,44 mM roztworu CaCl₂ w 15 mL stożkowym pojemniku.
   2. Wymieszaj w trybidoratorze przez 30 s aż do uzyskania jednorodności.
   3. Dodaj p-Asp powoli i dokładnie wymieszaj, aby ustabilizować amorficzny fosforan wapnia (ACP).
   4. Dodaj 5 mL roztworu fosforanowego (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) do roztworu wapniowego.
   5. Wymieszaj w trybidoratorze przez 1 min.
      UWAGA: Końcowe stężenia po wymieszaniu: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl i 50 μg/mL p-Asp.
   6. Przygotuj pożywkę do mineralizacji bezpośrednio przed użyciem. Nie przechowuj; używaj niestabilnego prekursora ACP natychmiast, aby uzyskać spójne wyniki.
      UWAGA: Przechowywanie prowadzi do przedwczesnej krystalizacji.
2. Przygotowanie pożywki do mineralizacji dla żeli kolagenowych/demineralizowanej dentyny
   1. Przygotuj roztwór zawierający wapń przez rozpuszczenie 8,77 g NaCl, 0,01 g NaN₃, 6,06 g Tris i 1,11 g CaCl₂ w 800 mL zdejonizowanej wody.
   2. Doprowadź objętość do 1 L zdejonizowaną wodą.
   3. Dodaj 350 μg/mL kwasu poliakrylowego (PAA, Mw ~1800) do roztworu zawierającego wapń.
   4. Wymieszaj w trybidoratorze przez 1 min.
      UWAGA: Użyj PAA zamiast p-Asp dla lepszej stabilizacji przy wyższych stężeniach wapnia.
   5. Przygotuj roztwór fosforanowy przez rozpuszczenie 0,85 g Na₂HPO₄ w 1 L zdejonizowanej wody, aby uzyskać 6 mM Na₂HPO₄.
   6. Sterylizuj przez przefiltrowanie za pomocą membrany 0,22 μm.
   7. Skojarz równe objętości (np. po 500 mL) roztworów wapnia i fosforanowego z mieszaniem magnetycznym przy 300 obr./min.
   8. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl lub NaOH, monitorując za pomocą pH-metra.
      UWAGA: Utrzymuj pH na poziomie 7,4 ± 0,1. Nie pozwalaj na odchylenia pH >0,2, które powodują przedwczesną krystalizację.

2. Przygotowanie włókien kolagenu rekombinowanego

1. Amino-silanizacja naczyń ze szkła
   UWAGA: To leczenie wykorzystuje (3-aminopropyl) trietoksysylan (APTES) do wprowadzenia dodatnio naładowanych grup aminowych (–NH₂) na powierzchnię szkła, co sprzyja adsorpcji elektrostatycznej i stabilizacji ujemnie naładowanych monomerów kolagenu.
   1. Dodaj 200 μL roztworu APTES (5% v/v w bezwodornym etanomie) do każdego naczynia kulturowego ze szkła (35 mm, #1.5H grubość, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Upewnij się, że powierzchnia naczynia jest całkowicie pokryta roztworem APTES.
   3. Inkubować w ciemności przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
   4. Spłucz naczynia trzy razy bezwodornym etanomem (2 mL na mycie).
   5. Ultradźwiękowo czyść w zdejonizowanej wodzie przez 10 minut

Results

Skuteczna implementacja tego protokołu daje wysokorozdzielczy, trójwymiarowy obraz zmineralizowanych włókien kolagenu za pomocą wielokolorowej 3D-STORM. Przedstawione poniżej wyniki ilustrują typowe rezultaty, kontrole jakości i ilościowe oceny.

Rysunek 1 przedstawia wielokolorową rekonstrukcję 3D-STORM sieci kolagenu zmineralizowanego amorficznym fosforanem wapnia (ACP). Kolagen (znakowany barwnikiem fluorescencyjnym o barwie czerwono-dalekiej) występuje jako dob...

Discussion

Ten protokół zapewnia kompleksowy proces wizualizacji mineralizacji kolagenu w skali nanometrów z wykorzystaniem wielokolorowej 3D-STORM. Kilka kluczowych kroków wymaga szczególnej uwagi, aby zapewnić udane wyniki.

Po pierwsze, przygotowanie próbki jest fundamentem dla wysokiej jakości obrazowania STORM. Amino-silanowane naczynia ze szkłem na dnie muszą być dokładne, aby zapewnić stabilne przymocowanie fibrili kolagenu w trakcie kolejnych kroków płukania i oznaczania. Pozostałości APTES mogą p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyaspartic acid (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Stabilizator dla amorficznego fosforanu wapnia
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Źródło wapnia
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Źródło fosforanów
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Regulator siły jonowej
Polyacrylic acid (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Stabilizator dla wysokiego stężenia wapnia
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503	Składnik buforu
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Środek przeciwdrobnoustrojowy
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Środek do funkcjonalizacji powierzchni szkła
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459836	Rozpuszczalnik
Type I collagen solution (50 μg/mL in 0.1 M acetic acid)	Corning	354249	Podłoże do samouzbrajania
Chondroitin sulfate (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Białko bezkolagenowe
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)	Sigma-Aldrich	E7750	Krzyżownik
NHS (N-hydroxysuccinimide)	Sigma-Aldrich	130672	Aktywator krzyżowania
MES free acid	Sigma-Aldrich	M5287	Bufor do krzyżowania
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	Bufor do mycia i rozcieńczania
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Środek blokujący
Rabbit anti-collagen-I antibody	Abcam	ab34710	Pierwotne przeciwciało przeciwko kolagenowi
Mouse anti-chondroitin sulfate antibody	Sigma-Aldrich	C8035	Pierwotne przeciwciało przeciwko CS
Goat anti-rabbit IgG conjugated to far-red fluorescent dye (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Przeciwciało wtórnego przeciwko kolagenowi
Goat anti-mouse IgM conjugated to red fluorescent dye (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Przeciwciało wtórnego przeciwko CS
Calcein (calcium indicator dye)	Sigma-Aldrich	C0875	Znaknik fosforanu wapnia
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Detergent do buforu myjącego
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Składnik buforu do obrazowania
Glucose oxidase (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Odchwytywacz tlenu
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345	Odchwytywacz tlenu
Cysteamine (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Tiol do mrugania fluoroforu
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Substrat dla oksydazy glukozy
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Bufor dla składu GOx
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Regulacja pH
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Regulacja pH
Phosphotungstic acid	Sigma-Aldrich	P4006	Ujemne barwienie do TEM
Glass-bottom culture dishes (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Podłoże próbki; grubość 0,17 mm
Ultrasonic cleaner (40 kHz)	Branson	B200	Urządzenie do czyszczenia
Humidity chamber	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Do samouzbrajania kolagenu
Transmission electron microscope	Hitachi	HT7800	Obrazowanie TEM
Formvar/carbon-coated TEM grids (200 mesh)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Podpora próbki TEM
Horizontal shaker platform	Labnet	S2030-RC	Delikatne mycie
Confocal laser scanning microscope	Nikon	A1	Wstępne badanie
3D-STORM microscope system (with 405/488/647 nm lasers, cylindrical lens, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Obrazowanie superrozdzielcze
100× oil immersion objective (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości
pH meter	Mettler Toledo	FiveGo F2	Kontrola pH
STORM acquisition and analysis software	Nikon	NIS-Elements (STORM module)	Nabywanie i przetwarzanie danych STORM
.nd2 file format (raw microscopy image file)	Nikon	N/A	Surowy format pliku obrazu generowany przez mikroskopy Nikon.
Publicly available image analysis software	Open source	N/A	np. ImageJ z wtyczką ThunderSTORM do analizy lokalizacji pojedynczych cząsteczek (współlokalizacja, korekcja dryfu)
Parafilm	Bemis	PM996	Pokrycie próbki podczas inkubacji
Aluminum foil	Any laboratory supplier	N/A	Do ochrony przed światłem (np. owijanie próbek)
Amber microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-669-21	Do ochrony przed światłem fluoroforów
Coverslips (No. 1.5)	Corning	2855-18	Montaż próbki