Techniki molekularne i immunologiczne w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu guza podścieliskowego przewodu pokarmowego

Nasz protokół opisuje hodowlę, utrzymanie, sekcję i przetwarzanie próbek jedynego obecnie używanego immunokompetentnego modelu myszy, GIST. Mamy nadzieję, że przyszli badacze będą w stanie wykorzystać ten mysi model do dalszych badań translacyjnych w GIST. Tradycyjne terapie w GIST obejmują celowaną terapię molekularną inhibitorami kinazy tyrozynowej.

Model ten umożliwia naukowcom testowanie immunoterapii w GIST. Na początek wysterylizuj wszystkie narzędzia, noś rękawiczki przez cały czas trwania zabiegu i utrzymuj sterylne pole. Przygotuj miejsce nacięcia za pomocą 70% etanolu.

Za pomocą nożyczek wykonaj dwucentymetrowe pionowe nacięcie w linii środkowej i wejdź do jamy brzusznej. Ostro zlikwiduj wszelkie zrosty wewnątrz brzucha. Aby usunąć drenujący węzeł chłonny krezkowy, zidentyfikuj jelito ślepe i unieś jego krezkę wyżej.

Mniej więcej w połowie drogi do podstawy krezki zidentyfikuj węzeł chłonny krezki i ostro go wypreparuj. W razie potrzeby podziel tkankę węzłów chłonnych na trzy części w celu izolacji białka, histologii i zawieszenia pojedynczej komórki. Umieść tkankę węzłów chłonnych w 20 mililitrach pożywki RPMI do zawiesin jednokomórkowych i trzymaj na lodzie.

Jelito ślepe jest najczęściej zastępowane przez GIST u myszy Kit558. W celu wyizolowania GIST i jelita ślepego ostrożnie oddzielić połączenie krętniczo-kolkowe od podstawy guza. Następnie ponownie podziel jelito ślepe, dwa centymetry dystalnie do podstawy guza.

U 50 do 60% myszy Kit558 głowa guza zawiera czapeczkę z tkanki jelita ślepego, która zwykle zawiera płyn surowiczy, ale rzadko może zawierać ropę. Ostro wypreparuj tkankę czapeczki z dala od tkanki nowotworowej. Podziel tkankę nowotworową i jelito ślepe na trzy części w celu izolacji białka, histologii i zawieszenia pojedynczej komórki.

W przypadku zawiesin jednokomórkowych umieść tkankę nowotworową lub jelito ślepe w HBSS z 2% FCS, wystarczającym do pokrycia próbki, i trzymaj na lodzie. Wlej pożywkę RPMI z próbką węzłów chłonnych przez filtr 100 mikrometrów. Przenieś filtr do nowego 50-mililitrowego stożkowego i zetrzyj węzeł chłonny miękkim końcem trzymililitrowej plastikowej strzykawki.

Umyj filtr 20 mililitrami środka RPMI. Odwirować próbki i odessać supernatant. Ponownie zawiesić granulat w 20 mililitrach bufora perełkowego i zalać 40-mikrometrowym filtrem.

Zebrać filtrat komórkowy. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Odwirować próbki i odrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawiesić w buforze kulkowym do cytometrii przepływowej. Przygotować bufor kolagenazy zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu. Umieść GIST w sterylnym naczyniu i dodaj 2,5 mililitra buforu kolagenazy.

Za pomocą sterylnego skalpela i nożyczek zmiel guz, aż znajdzie się w drobnych fragmentach. Użyj pipety o dużej średnicy, aby zassać guz i kolagenazę do 50-mililitrowej probówki. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przy 100 obrotach na minutę, a następnie wygaszaj reakcję dwoma mililitrami FBS.

Wlej kolagenazę z próbką GIST na filtr 100 mikrometrów i rozgnieć guz miękkim końcem trzymililitrowej plastikowej strzykawki i zbierz w 50-mililitrowej probówce. Umyj filtr 20 mililitrami HBSS. Odwirować filtrat w temperaturze 450 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w 20 mililitrach bufora perełkowego i zalać filtrem 40-mikrometrowym Zebrać filtrat i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Odwirować i odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić w buforze kulkowym do cytometrii przepływowej. Za pomocą nożyczek rozłup jelito ślepe wzdłużnie, aby odsłonić wewnętrzną błonę śluzową.

Pokrój go na 0,5-centymetrowe odcinki i umieść w 50-mililitrowej tubie z pięcioma mililitrami HBSS i 2% FBS. Wstrząsać energicznie przez 30 sekund i wirować w temperaturze 450 RCF przez 20 sekund. Następnie odrzucić supernatant.

Dodaj od pięciu do 20 mililitrów HBSS z dwumilimolowym EDTA. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 100 obrotach na minutę przez 15 minut. Odwirować i wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w pięciu do 20 mililitrach HBSS.

Potrząsać mieszaniną energicznie przez 30 sekund, następnie odwirować w temperaturze 450 RCF przez 20 sekund i wyrzucić supernatant. Powtórz ten proces jeszcze raz. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu kolagenazy, a następnie inkubować go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przy 100 obrotach na minutę.

Wstrząsać energicznie co 10 minut i ugasić reakcję dwoma mililitrami FBS. Wlej kolagenazę z próbką jelita ślepego na filtr 100 mikrometrów i rozgnieć miękką końcówką trzymililitrowej plastikowej strzykawki. Umyj filtr 20 mililitrami HBSS i zbierz filtrat.

Odwirować i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulat w 20 mililitrach bufora perełkowego i zalać 40-mikrometrowym filtrem. Zebrać filtrat i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

Powtórzyć proces wirowania jeszcze raz i ponownie zawiesić osad w buforze kulkowym do cytometrii przepływowej. Myszy Kit558 miały średnią długość życia wynoszącą osiem miesięcy z powodu postępującej niedrożności jelit. Guzy myszy Kit558 wykazywały ekspresję kanonicznych markerów GIST, w tym kinazy tyrozynowej KIT, kanału transbłonowego Dog1 i czynnika transkrypcyjnego ETV1.

Guzy badano pod kątem zmian w szlaku sygnałowym KIT, takich jak dalsze markery ERK i AKT lub mikrośrodowisko immunologiczne, które ściśle naśladowało ludzki GIST. Rezonans magnetyczny lub CT używano do śledzenia objętości guza jako dokładnego pomiaru odpowiedzi guza. Wypreparowanie guza z dala od połączenia krętniczo-kolniczego i z dala od czapeczki kątowej jest ważne dla uchwycenia prawdziwej masy guza oraz analizy immunologicznej i molekularnej.

W ramach GIST model ten pozwolił na badanie mikrośrodowiska guza, a także immunoterapii.