Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej
July 19th, 2024
Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.
Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem procesów fizjologicznych zachodzących w całej komórce, szczególnie na granicy faz błony. Używamy cryoEM jako głównej techniki i pracujemy nad różnymi interesującymi i wymagającymi problemami biologicznymi, badając wiele kompleksów makromolekularnych. Określenie struktur białek błonowych i innych labilnych kompleksów było wyzwaniem kilka dekad temu.
Jednak postęp techniczny w dziedzinie krioEM oraz nowatorskie środowiska detergentów i mimetyków lipidów utorowały drogę do szybkiego określenia struktury tych kompleksów. Struktury te można teraz uzyskać w wysokiej rozdzielczości i potencjalnie wykorzystać w odkrywaniu leków. W przypadku krioEM-u z pojedynczymi cząstkami wyzwania obejmują uzyskanie stabilnej i jednorodnej próbki, osadzenie próbki w losowej orientacji w cienkim lodzie, przetwarzanie dużej liczby obrazów przy niskim stosunku sygnału do szumu oraz dokładne określenie orientacji kątowej i klasyfikacji podczas rekonstrukcji 3D.
Identyfikacja i modelowanie małych cząsteczek na mapach krioEM kompleksów białek ligandowych jest trudne ze względu na nieodłączny szum w danych oraz izotropową i niską rozdzielczość mapy, niejednorodność próbki i elastyczność ligandów. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym identyfikacji i modelowania ligandów i cząsteczek rozpuszczalników na mapach krioEM o niskiej i średniej rozdzielczości. Zacznij od pobrania nienaostrzonych map połówkowych apo-enolazy z dodatkowych danych w EMDB.
Następnie otwórz ChimeraX i kliknij Otwórz na pasku narzędzi. Wybierz mapy połówkowe apo-enolazy. Wpisz to w wierszu poleceń, aby połączyć połówki map i uzyskać niewyostrzoną mapę apo-enolase.
Dostosuj próg mapy do 0,0595, aby zredukować szumy. Następnie wpisz to polecenie, aby zmienić nazwę połączonej mapy. Kliknij Otwórz.
Wybierz PEP enolase niezaostrzone mapy połówkowe i wpisz to polecenie w wierszu poleceń. Dostosuj próg mapy do 0,0721, aby zredukować szum i zmienić nazwę mapy. Następnie wyświetl niewyostrzone mapy enolazy apo-enolase i PEP i kliknij Dopasuj w panelu mapy, aby obliczyć mapę różnic.
Wpisz to polecenie w wierszu polecenia, aby odjąć mapę enolazy PEP od mapy apo-enolase i dostosować próg. Pokoloruj odjętą mapę na zielono, co oznacza gęstość dodatnią. Następnie otwórz PDB i pobierz współrzędne enolazy oktomerycznej Mycobacterium tuberculosis.
Następnie w ChimeraX kliknij Otwórz na pasku narzędzi i wybierz nazwę pliku. Kliknij Wyświetlanie molekuł, Ukryj atomy i Pokaż kreskówkę. Wpisz to polecenie, aby zmienić nazwę modelu.
Wybierz model z panelu modelu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na pasku narzędzi. Następnie kliknij przycisk Przenieś model i umieść model w pobliżu mapy enolazy PEP.
Wyrównaj model względem mapy. Dopasuj ten model do niewyostrzonej mapy enolazy PEP, wpisując to polecenie w wierszu polecenia. Sprawdź dopasowanie.
Dostosuj reprezentację koloru i struktury. Otwórz Coot z terminala, wpisując coot Kliknij Plik, a następnie Otwórz współrzędne i wybierz Apo-enolase.pdb. Następnie pobierz mapę zaostrzoną enolazą związaną z PEP z EMDB.
Wyświetl tę mapę w Coot, klikając Plik i Otwórz mapę. Przewiń środkowy przycisk myszy, aby ustawić próg na 7.00 sigma. Kliknij pozycję Weryfikuj, a następnie pozycję Niemodelowane obiekty blob.
W nowym oknie wpisz 7.00 jako RMSD i kliknij Znajdź obiekty blob. Zlokalizuj niemodelowaną gęstość liganda w pobliżu reszt miejsca aktywnego seryny-42, lizyny-386 i argininy-364. Następnie kliknij Plik, Pobierz monomer i wprowadź PEP, aby pobrać plik modelu monomeru PEP z biblioteki monomerów Coot.
Przesuń cząsteczkę PEP do gęstości za pomocą opcji obróć/przesuń cząsteczkę łańcucha strefy w menu paska bocznego. Następnie kliknij strefę uściślania w przestrzeni rzeczywistej w menu paska bocznego, aby dopasować cząsteczkę PEP do gęstości. Oceń dopasowanie i kliknij Akceptuj po zakończeniu.
Użyj opcji Scal cząsteczkę na karcie Edycja, aby scalić dopasowany ligand z modelem apo-enolase i zapisać model jako pep-enolase.pdb. Następnie kliknij Oblicz, NCS narzędzia, a następnie NCS Ligandy, aby dodać ligandy do pozostałych monomerów w pliku współrzędnych. Dla opcji białka z NCS należy wybrać plik współrzędnych apo-enolaza.
pdb i identyfikator łańcucha A jako główny łańcuch NCS. Następnie dla cząsteczki zawierającej ligand wybierz apo-enolazę. pdb jako plik współrzędnych, identyfikator łańcucha J i numer pozostałości od 1 do 1.
Kliknij Znajdź stanowiska kandydatów. Kliknij na poszczególne kandydujące ligandy i przeanalizuj wizualnie dopasowanie. Następnie zamodeluj dwa jony magnezu w gęstości miejsca aktywnego, klikając na umieść atom na wskaźniku i wybierając Mg z listy typów atomów wskaźnika.
Dodaj również jony magnezu w monomerach związanych z symetrią. Oceń dopasowanie dla atomów magnezu związanych z symetrią. Zapisz model, klikając Plik, a następnie Zapisz współrzędne, wybierz nazwę pliku i wpisując Enolase+PEP+Mg.pdb.
Następnie otwórz Phenix GUI. Uruchom zadanie uściślania w czasie rzeczywistym przy użyciu parametrów domyślnych z zapisanym modelem i zaostrzoną mapą powiązaną z PEP. Aby zwizualizować modelowany ligand, otwórz PyMOL.
Kliknij Plik i Otwórz, aby załadować udoskonalony model z zadania uściślania Phenix. Załaduj również zaostrzoną mapę z PEP. Zmień nazwę mapy na wyostrzoną PEP, klikając Akcje, a następnie zmień nazwę.
Następnie wybierz ligandy, klikając Wyświetlacz, a następnie Sekwencja. Wpisz to w wierszu poleceń i naciśnij enter. Spowoduje to wyrzeźbienie gęstości mapy wokół zaznaczenia.
Kliknij ostatnie pole, C, obok mesh_ligand obiektu, aby zmienić kolor siatki liganda na niebieski. Wyświetlanie reszt miejsca aktywnego oddziałujących z PEP i jonami magnezu w reprezentacji patyczków i kul oraz enzymu enolazy w reprezentacji kreskówki. Ustaw rozmiar siatki.
Wpisz to w wierszu poleceń, aby wykonać śledzenie promieni i zapisać obraz jako plik PNG. Podczas glikolizy enolaza przekształca 2-fosfoglicerynian w fosfoenolopirogronian, niezbędny produkt pośredni dla różnych szlaków metabolicznych. Mapa różnic między apoenzymem a enzymem związanym z PEP wykazała wyraźną gęstość ligandów.
Zaobserwowano również dodatkowe zagęszczenie w miejscu aktywnym modelowanego białka. Fosfoenolopirogronian i dwa jony magnezu modelowano w gęstości obserwowanej w pobliżu liganda. Fosfoenolopirogronian tworzył wiązania wodorowe z kilkoma resztami w miejscu aktywnym, takimi jak lizyna-386 i arginina-364.
Jony magnezu tworzyły wiązania koordynacyjne metali z asparaginianem-241, glutaminianem-283, asparaginianem-310 i fosforanem fosfoenolopirogronianu.
Przegląd
Ten protokół przedstawia narzędzia dostępne do modelowania ligandów małych cząsteczek w mapach cryoEM makrocząsteczek. Badanie koncentruje się na zrozumieniu procesów fizjologicznych na granicy błony za pomocą cryoEM, aby rozwiązać różne wyzwania biologiczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia krioelektronowa (cryoEM)
- Kompleksy makrocząsteczkowe
- Odkrywanie leków
Tło
- Zrozumienie procesów fizjologicznych w komórce.
- Wyzwania w określaniu struktur białek błonowych.
- Postępy w technikach cryoEM.
- Znaczenie wysokiej rozdzielczości struktur dla odkrywania leków.
Cel badania
- Modelowanie ligandów małych cząsteczek w mapach cryoEM.
- Poprawa rozumienia struktur białek błonowych.
- Ułatwienie szybkiej oznaczania struktur kompleksów nietrwałych.
Stosowane metody
- Technika krioelektronowej mikroskopii pojedynczych cząstek.
- Wtopienie próbek w cienką warstwę lodu.
- Przetwarzanie obrazów o niskim stosunku sygnału do szumu.
- 3D rekonstrukcja i klasyfikacja orientacji kątowej.
Główne wyniki
- Uzyskano wysokiej rozdzielczości struktury białek błonowych.
- Sukces w modelowaniu ligandów małych cząsteczek w mapach cryoEM.
- Pokonanie wyzwań związanych ze stabilnością i jednorodnością próbek.
- Postępy w potencjale odkrywania leków dzięki wnioskom strukturalnym.
Wnioski
- CryoEM jest potężnym narzędziem do badania kompleksów makrocząsteczkowych.
- Modelowanie ligandów poprawia zrozumienie interakcji leków.
- Postępy techniczne nadal poprawiają badania nad biologią strukturalną.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution modeling of protein-ligand interactions using cryoEM maps is increasingly critical for early-stage drug discovery and mechanistic de-risking. The ability to accurately identify and refine ligand binding in complex macromolecular assemblies supports predictive confidence in target validation and informs portfolio triage decisions. Integrating advanced cryoEM workflows enables biopharma teams to address structural ambiguity and accelerate structure-based lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of ligand binding sites and interaction networks in macromolecular complexes.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the structural basis of target engagement.
- Improves predictive confidence for functional target validation and downstream triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated structural models for computational and experimental screening workflows.
- Enables reproducible identification of ligand densities and quantitative assessment of binding modes.
- Supports assay standardization by providing reference structures for ligand-bound and apo states.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural insights with disease-relevant systems by modeling physiologically important complexes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting structure-guided optimization.
- Reduces translational risk by confirming ligand engagement in relevant biological assemblies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryoEM-based ligand modeling workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by delivering high-confidence structural data for hypothesis testing and compound optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of ligand binding and pathway modulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative ligand density maps for comparative analysis.
- Analytics: Delivers refined atomic coordinates and difference maps to support statistical evaluation of binding events.
- Translational Research: Connects structural findings to disease-relevant targets and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for ongoing structure-based drug design initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes ligand modeling and refinement across diverse protein systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by reducing late-stage structural risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM data processing, model building, and refinement software.
- Demands access to high-performance computational infrastructure and visualization tools.
- Necessitates cross-team standardization of map thresholds, validation criteria, and coordinate refinement.
- May require adaptation for different protein classes, ligand types, or resolution regimes.
- Dependent on sample quality, map resolution, and inherent noise limitations in cryoEM data.
