Um Protocolo Multicolorido de Visualização de Alta Resolução 3D-STORM para Mineralização de Colágeno em Fibrilas de Colágeno Tipo I Recombinantes Auto-Montadas

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para distinguir a mineralização intrafibrilar da extrafibrilar em fibrilas de colágeno recombinante usando o 3D-STORM multicolorido, integrando marcação otimizada, imagem e análise quantitativa de colocalização.

Abstract

Este protocolo descreve um método de microscopia de reconstrução óptica estocástica tridimensional multicolorida (3D-STORM) para visualização em nanoescala da mineralização de colágeno em um modelo de fibrila automontada de colágeno tipo I recombinante. O método permite a imagem simultânea de colágeno, proteínas não colagenosas (por exemplo, sulfato de condroitina) e fases minerais de fosfato de cálcio. A preparação da amostra envolve aminosilanização e auto-montagem de colágeno, seguida pela mineralização usando um meio de fosfato de cálcio que forma fosfato de cálcio amorfo (ACP) em estágio inicial (30 min) e amadurece em hidroxiapatita (HAP) em 6 horas. A marcação multiplexada por imunofluorescência é então realizada, e as amostras são primeiro avaliadas por microscopia confocal antes da aquisição da imagem 3D-STORM usando um tampão de imagem de absorção de oxigênio. O processamento e a análise de dados são realizados usando software disponível publicamente. Comparado à microscopia eletrônica ou confocal convencional, este protocolo combina especificidade molecular com resolução em nanoescala (precisão lateral típica 20–30 nm, axial 50–60 nm), permitindo visualização tridimensional dos padrões de mineralização intrafibrilar versus extrafibrilar. Resultados representativos mostram uma visualização clara das redes de colágeno, proteínas não colágenos associadas e fases minerais dentro do espaço tridimensional. Métricas quantitativas incluindo o coeficiente de correlação de Pearson (0,89 ± 0,04) e o coeficiente de sobreposição de Manders (0,91 ± 0,03) são fornecidas na seção de Resultados. Esse protocolo oferece uma ferramenta poderosa para pesquisadores em ciência de biomateriais, biomineralização e engenharia de tecidos ósseos que necessitam de conhecimento em escala nanométrica sobre dinâmica de mineralização.

Introduction

A mineralização do colágeno é um processo biológico fundamental fundamental na formação de tecidos duros, como ossos e^dentes. A estrutura intrincada das fibras de colágeno, aliada à regulação finamente ajustada da deposição mineral, confere notável resistência mecânica e integridade estrutural a^{esses tecidos 2}. O colágeno serve não apenas como um andaime passivo, mas como participante ativo, orquestrando deposições minerais precisas por meio de interações moleculares e físicas^{complexas 3}. Elucidar esses mecanismos é crucial para compreender condições patológicas como osteoporose e cárie dentária, e para desenvolver materiais biomiméticos para terapias^{regenerativas 4}.

O diâmetro das fibras de colágeno nos tecidos duros varia de aproximadamente 50 a 100 nm, com as partículas de hidroxiapatita (HAP) sendo ainda menores (tipicamente de 2 a 5 nm de espessura e 20 a 30 nm de comprimento) e intercaladas dentro de lacunas^{fibrilares 5}. Embora as zonas de lacuna possam atuar como sítios de nucleação, nos tecidos nativos, os minerais inicialmente se formam em espaços interfibrilares e subsequentemente se expandem para compartimentos intrafibrilares. Métodos tradicionais de caracterização incluem coloração histológica, microscopia de varredura a laser^{confocal 6,7} e microscopia eletrônica ^8,9. A coloração histológica fornece uma avaliação macroscópica, mas não pode avaliar estados de mineralização em escala nanométrica. A microscopia confocal permite a observação de componentes específicos, mas é limitada por difração (~200 nm lateralmente), incapaz de resolver a mineralização intrafibrilar versus^{extrafibrilar 10}. A microscopia eletrônica oferece alta resolução, mas carece de especificidade molecular. Embora a marcação imunoouro possa fornecer especificidade molecular para microscopia eletrônica, ela requer processamento especializado e é menos adequada à visualização multiplexada e tridimensional de múltiplos componentes em comparação com o STORM, envolvendo longos ciclos experimentais e altos^{custos 11}.

A microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) supera o limite de difração ao localizar fluoróforos individuais com alta precisão, alcançando resolução lateral^{de ~20 nm 12}. Em comparação com outras técnicas de super-resolução, como a microscopia de depleção por emissão estimulada (STED⁾¹³e a microscopia de iluminação estruturada (SIM⁾¹⁴, o STORM oferece maior precisão de localização (~20 nm lateralmente e ~50 nm axialmente) e é compatível com uma gama mais ampla de fluoróforos orgânicos. Em particular, o STED requer corantes especializados e altas potências de laser que podem danificar amostras biológicas, enquanto o SIM oferece apenas ~100 nm de resolução, insuficiente para resolver características em escala de fibrila (50–100 nm). O STORM oferece um equilíbrio prático entre resolução, capacidade de multiplexação e compatibilidade de amostras. Diretrizes publicadas descreveram amostras padronizadas para facilitar a otimização dos parâmetros de imagem STORM e a avaliação^{de resolução 15}. Quando combinado com capacidades de imagem tridimensional, o 3D-STORM permite a visualização em nanoescala de múltiplos componentes^{simultaneamente 16}. Avanços recentes estenderam o STORM para imagens multicoloridas e multiplexadas, permitindo a visualização de múltiplos alvos dentro da mesma amostra^17,18.

Esse protocolo utiliza um modelo biomimético in vitro baseado em fibrilas de colágeno tipo I recombinantes auto-montadas e é explicitamente projetado para modelos de fibrila auto-montada de colágeno tipo I recombinante in vitro, a fim de distinguir a mineralização intrafibrilar da extrafibrilar em nanoescala. Não é adequado para imagens de células vivas, pois o STORM requer amostras fixas e tampões que capturam oxigênio. Também não é adequado para tecidos nativos altamente mineralizados (por exemplo, osso maduro) sem descalcificação prévia ou coleta de antígenos. Se apenas a densidade mineral geral ou a morfologia de grande área precisarem de avaliação, a microscopia confocal convencional ou eletrônica é mais eficiente.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho padronizado e gradual para o uso do 3D-STORM multicolorido para visualizar a distribuição em nanoescala de minerais e proteínas não colagênicas dentro das fibrilas individuais de colágeno, com ênfase específica na distinção entre mineralização intrafibrilar e extrafibrilar. Esse protocolo integra imunomarcação otimizada com um tampão de imagem personalizado para permitir o acompanhamento simultâneo de múltiplos componentes orgânicos (colágeno, proteínas não colagnósticas) e fases inorgânicas (ACP, HAP) em três dimensões¹⁹. Uma inovação chave é a avaliação quantitativa dos padrões de mineralização intrafibrilar versus extrafibrilar. A quantificação é alcançada por dois critérios independentes: (1) calcular o coeficiente de colocalização de Pearson entre os canais do mineral (um corante indicador de cálcio (por exemplo, calcina) e colágeno (um corante fluorescente de vermelho distante) usando o módulo de colocalização em software de análise de imagem (coeficiente >0,8 indica forte associação); (2) analisar a persistência do sinal mineral ao longo das fatias Z de fibrilas individuais: se sinal mineral estiver presente em fatias centrais (Z = 0 a ±120 nm do centro vertical da fibrila) na intensidade ≥50% do máximo, ele é classificado como intrafibrilar. Diferentemente da microscopia eletrônica ou confocal convencional, este protocolo combina especificidade molecular com resolução em escala nanométrica, permitindo a distribuição espacial tridimensional da mineralização intrafibrilar.

Este protocolo foi desenvolvido para pesquisadores em ciência de biomateriais, biomineralização e engenharia de tecidos ósseos que necessitam de conhecimento em escala nanométrica sobre dinâmica mineralização. O procedimento padronizado também pode ser adaptado para estudar outros sistemas mineralizados de colágeno, como fatias de dentina desmineralizadas ou hidrogéis à base de colágeno, ajustando as etapas iniciais de preparação da amostra de acordo.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo amostras biológicas foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos das Instalações Centrais da Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang e aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (Certificado de Aprovação nº BSL20235710079). O protocolo experimental descrito aqui utiliza reagentes de origem comercial e sistemas biomiméticos in vitro. Não envolve participantes humanos, animais ou amostras de tecido humano, e, portanto, não requer aprovação ética de um conselho institucional de revisão.

ATENÇÃO: Todos os procedimentos envolvendo produtos químicos perigosos devem ser realizados em uma exaustão exaustiva com equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas, óculos de segurança). Descarte resíduos químicos conforme as regulamentações institucionais. Para NaN₃, recolha resíduos em um recipiente dedicado marcado como "resíduos azida" e não misture com ácidos (risco de gás explosivo). Para glutaraldeído, inative com 10% de excesso de bissulfito de sódio antes do descarte. Para β-mercaptoetanol, oxide com água sanitária (1:10 v/v) por 1 h antes do descarte pelo dreno.

NOTA: A marcação por imunofluorescência DEVE ser realizada ANTES da mineralização para evitar mascaramento de epítopos por depósitos minerais. Para aplicações que exigem marcação pós-mineralização, pode ser necessária a recuperação de antígenos.

1. Preparação do meio mineralizador

1. Preparação de meio mineralizador para fibrilas de colágeno reconstituídas
   1. Prepare a solução de estoque de cálcio adicionando 100 μL de ácido poliaspártico de 5 mg/mL (p-Asp, Mw 9-11 kDa) gota a gota a 5 mL de solução de CaCl₂ 3,44 mM em um tubo cônico de 15 mL.
   2. Misture o vórtice no tubo por 30 segundos até ficar homogêneo.
   3. Adicione o p-Asp lentamente e misture bem para estabilizar o fosfato de cálcio amorfo (ACP).
   4. Adicione 5 mL de solução de fosfato (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) à solução de estoque de cálcio.
   5. Mistura de vórtice por 1 minuto.
      NOTA: Concentrações finais após a mistura: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl e 50 μg/mL p-Asp.
   6. Prepare o meio mineralizado imediatamente antes do uso. Não armazene; use imediatamente o precursor instável do ACP para obter resultados consistentes.
      NOTA: O armazenamento leva à cristalização prematura.
2. Preparação de meio mineralizado para géis de colágeno/dentina desmineralizada
   1. Prepare uma solução contendo cálcio dissolvendo 8,77 g de NaCl, 0,01 g de NaN₃, 6,06 g de Tris e 1,11 g de CaCl₂ em 800 mL de água desionizada.
   2. Aumente o volume para 1 L com água desionizada.
   3. Adicione 350 μg/mL de ácido poliacrílico (PAA, Mw ~1800) à solução contendo cálcio.
   4. Vórtice por 1 minuto.
      NOTA: Use PAA em vez de p-Asp para melhor estabilização em concentrações mais altas de cálcio.
   5. Prepare a solução de fosfato dissolvendo 0,85 g de Na₂HPO₄ em 1 L de água desionizada para obter 6 mM de Na₂HPO₄.
   6. Esterilize a solução de fosfato com filtro usando uma membrana de 0,22 μm.
   7. Combine volumes iguais (por exemplo, 500 mL cada) de soluções de cálcio e fosfato com agitação magnética a 300 rpm.
   8. Ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl ou NaOH enquanto monitora com um medidor de pH.
      NOTA: Mantenha o pH em 7,4 ± 0,1. Não permita desvios de pH >0,2, que causem cristalização prematura.

2. Preparação de fibras de colágeno recombinantes

1. Amino-silanização de pratos de fundo de vidro
   NOTA: Este tratamento utiliza (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) para introduzir grupos amino carregados positivamente (-NH₂) na superfície do vidro, promovendo a adsorção eletrostática e estabilização de monômeros de colágeno carregados negativamente.
   1. Adicione 200 μL de solução APTES (5% v/v em etanol absoluto) a cada recipiente de cultura com fundo de vidro (35 mm, #1,5H espessura, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Garanta cobertura completa da superfície do prato com a solução APTES.
   3. Incubar no escuro por 2 horas em temperatura ambiente (20–25 °C).
   4. Enxágue a louça três vezes com etanol absoluto (2 mL por lavagem).
   5. Ultrasultrasonice em água desionizada por 10 minutos a 40 kHz. Remova completamente os resíduos de APTES para evitar ligações inespecíficas.
   6. Pratos silanizados podem ser armazenados secos a 4 °C por até 1 semana.
   7. (Opcional) Asse para maior estabilidade: Coloque as louças lavadas e secas no forno a 100–120 °C por 30–60 minutos.
   8. Deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de prosseguir.
      NOTA: Se usar pratos de plástico, reduza a temperatura para menos de 80 °C para evitar deformações. Adapte o procedimento de silanização de Bitter e^{Muir 20}.
2. Auto-montagem do colágeno e reticulação
   1. Pipete 100 μL de solução de colágeno-I (50 μg/mL em 0,1 M ácido acético) em cada prato silanizado.
   2. Incube a 37 °C por 10 horas em uma câmara de umidade (> 90% de umidade relativa). Mantenha uma umidade estável para evitar a evaporação da solução.
   3. Verificar a formação da fibrila com microscopia de contraste de fase ou confocal; Uma preparação bem-sucedida mostra uma rede fina, semelhante a uma teia, de fibrilas.
   4. Para verificar a formação correta da fibrila no nível ultraestrutural, prepare uma amostra separada em uma grade TEM formal/revestida de carbono polivinilo, seguindo as mesmas condições de auto-montagem (colágeno-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 h, umidade > 90%).
   5. Tinga com ácido fosfotungístico a 1% (pH 7,0) por 10 minutos.
   6. Lave com água desionizada.
   7. Examine sob um microscópio eletrônico de transmissão. A fibriogênese bem-sucedida é indicada pelo padrão característico de bandas periódicas D de 67 nm (ver Figura 3).
   8. Aspire cuidadosamente a solução residual de colágeno dos recipientes com fundo de vidro.
   9. Adicione 2 mL de solução de sulfato de condroitina (CS) (50 mg/mL em PBS, pH 5,5) em cada recipiente.
   10. Incube a 4 °C por 12 horas para permitir a adsorção eletrostática do CS nas fibrilas de colágeno.
   11. Prepare a solução de reticulação EDC/^{NHS 21}: dissolver 0,2 M EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) e 0,05 M NHS (N-hidroxisuccinimida) no tampão MES (0,1 M MES, pH 5,5).
       NOTA: O tampão MES pode ser preparado dissolvendo ácido livre MES em água desionizada e ajustando o pH para 5,5 com NaOH.
   12. Remova a solução CS e adicione 2 mL da solução de crosslinking EDC/NHS.
   13. Incube em temperatura ambiente por 2 horas para imobilizar covalentemente o CS no colágeno.
   14. Lave a louça três vezes com PBS (5 mL cada, 5 min cada) para remover reagentes não reagidos.
   15. Armazene fibras de colágeno processadas em PBS a 4 °C por até 24 horas antes da mineralização.

3. Marcagem por imunofluorescência (realizada ANTES da mineralização)

1. Preparação de amostras
   1. Enxágue fibrilas de colágeno três vezes com solução de NaCl de 500 mM (10 mL por lavagem, 5 min cada).
   2. Lave três vezes com água desionizada (10 mL por lavagem, 5 min cada).
   3. Realize lavagens em uma plataforma shaker horizontal girando a 50 rpm para garantir uma lavagem completa, minimizando as forças de cisalhamento que poderiam desprender fibrilas montadas.
2. Bloqueio e incubação primária de anticorpos
   1. Incubar com tampão bloqueante (5% de albumina sérica bovina em PBS) a 37 °C por 1 hora em uma câmara umidificada.
   2. Prepare um coquetel de anticorpos em buffer bloqueante: anticolágeno-I de coelho (diluição 1:100) e sulfato de anticondroitina de camundongos (diluição 1:100).
   3. Adicione 200 μL de coquetel de anticorpos por amostra.
   4. Cubra as amostras com filme de vedação laboratorial.
   5. Incubar a 4 °C durante a noite (12–16 h).
   6. Proteja da luz usando papel alumínio. Após a incubação primária de anticorpos, as amostras podem ser armazenadas em PBS a 4 °C por até 24 horas.
3. Coloração secundária por anticorpos
   1. Remova os anticorpos primários não ligados lavando a louça três vezes com buffer de lavagem (0,1% Tween-20 no PBS), 10 minutos em cada lavagem.
   2. Prepare a mistura secundária de anticorpos fluorescentes em um tampão bloqueador (200 μL por prato de 35 mm) contendo: IgG anti-coelho de cabra conjugado a um corante fluorescente vermelho profundo (1:100) e IgM anti-camundongo conjugado a um corante fluorescente vermelho (1:100).
      NOTA: A partir deste passo, proteja as amostras da luz para evitar o fotobranqueamento do fluoróforo.
   3. Incube amostras em temperatura ambiente (20–25 °C) por 1 hora no escuro.
   4. Lave a louça três vezes com tampão de lavagem (10 min cada) para remover os anticorpos secundários não ligados.
      NOTA: Armazene as amostras rotuladas em PBS a 4 °C (protegidas contra a luz) por até 48 horas antes da imagem. Inclua controles sem anticorpos primários para verificar autofluorescência.

4. Mineralização das fibras de colágeno (realizada APÓS a marcação)

1. Processo de mineralização
   1. Adicione 2 mL de meio mineralizado recém-preparado por travessa.
   2. Incubar a 37 °C por 30 minutos (curto prazo) para formação mineral em estágio inicial (ACP).
   3. Alternativamente, incubar a 37 °C por 6 h (a longo prazo) para cristalização de minerais maduros (HAP).
      NOTA: Mantenha a temperatura exata em 37 °C ± 0,5 °C usando uma incubadora calibrada.
   4. Aspire suavemente o meio mineralizado.
   5. Enxágue três vezes com água desionizada (5 mL por lavagem, intervalos de 1 minuto).
2. Marcagem com fosfato de cálcio
   1. Adicione 4 μM de um corante indicador de cálcio (por exemplo, calcina) em PBS (200 μL por prato).
   2. Incube em temperatura ambiente (20–25 °C) por 30 minutos no escuro.
      NOTA: O corante indicador de cálcio (por exemplo, calcina) liga-se aos íons de cálcio e não discrimina entre fases amorfa e cristalina; a atribuição de fases é baseada no tempo de mineralização (30 min = ACP, 6 h = HAP). Deve ser protegido da luz usando tubos âmbar ou papel alumínio.
   3. Enxágue cinco vezes: três lavagens com água desionizada e duas lavagens com etanol a 70% (1 min cada), alternando entre as duas.
3. Preparação da amostra para imagem
   1. Imergir amostras em tampão de imagem: glicerol 10% (p/v) em PBS. Opcionalmente, adicione um reagente antidesfaçamento conforme as instruções do fabricante.
   2. Aplique um volume suficiente (20–50 μL) de tampão de imagem para cobrir a amostra.
   3. Coloque uma cobertura sobre a amostra.
   4. Armazene as amostras a 4 °C no escuro por até 72 horas.

5. Observação sob microscópio confocal a laser

1. Transferência de amostras do armazenamento a 4 °C para a temperatura ambiente (20–25 °C).
2. Deixe 10 minutos de equilíbrio para evitar condensação.
3. Mantenha proteção leve usando recipientes âmbar ou filme alumínio.
4. Verifique se o buffer de imagem cobre toda a amostra.
5. Configure o microscópio confocal com as seguintes configurações:
   1. Para imagem de colágeno (corante fluorescente vermelho distante): laser de 647 nm, filtro de emissão de 650-710 nm.
   2. Para imagem de fosfato de cálcio (corante indicador de cálcio (por exemplo, calcina)): laser de 488 nm, filtro de emissão de 500-550 nm.
   3. Objetivo: 100× imersão em óleo (NA 1,4).
   4. Diâmetro do orifício estenopeico: 1 unidade aérea (UA).
   5. Tempo de permanência dos pixels: 1-2 μs.
      NOTA: Realize alinhamento a laser e calibração de orifícios antes da imagem.
6. Realize varredura sequencial: primeiro exame com excitação de 647 nm (colágeno).
7. Realize uma segunda varredura com excitação de 488 nm (mineral).
   NOTA: Colete canais sequencialmente para evitar o bleed through.
8. Para reconstrução 3D, ajuste o tamanho do passo da pilha Z para 0,5 μm ou menor para garantir uma amostragem adequada.
9. Arquivos salvos com metadados preservados.
10. Para análise de colocalização, utilize softwares de análise de imagem capazes de calcular o coeficiente de correlação de Pearson (por exemplo, softwares públicos com plugins adequados).

6. Imagem por microscopia de reconstrução óptica estocástica tridimensional (3D-STORM)

1. Preparação do buffer de imagem^{STORM 22}
   NOTA: Glicose oxidase e catalase são adicionadas ao buffer de imagem para captar oxigênio, reduzindo assim o fotobranqueamento e prolongando o piscar dos fluoróforos, essencial para a localização de moléculas individuais no STORM.
   1. Prepare uma solução de estoque de glicose oxidase (GOx) a 8 mg/mL em 50 mM de acetato de sódio (pH 5,1).
   2. Prepare uma solução de estoque de catalase a 160 μg/mL em 1× PBS.
      NOTA: Aliquota os estoques enzimáticos, congele-os rapidamente usando nitrogênio líquido ou um banho de gelo seco/etanol, e armazene a -20 °C ou -80 °C. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
   3. Prepare um novo buffer de imagem STORM sobre gelo, protegido da luz.
   4. Combine os seguintes componentes na ordem listada para um volume final de 1 mL: H₂O estéril livre de nuclease (até 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM final), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM final), 1 M cisteamina (MEA) recém-preparada ajustada a pH ~7,0 (50 μL, 50 mM final), glicose 50% (p/v) (200 μL, 10% em peso e volume final), estoque GOx (200 μL, 1,6 mg/mL final), estoque de catalase (200 μL, 32 μg/mL final).
   5. Misture suavemente pipetando ou invertendo. Não faça vórtice.
      NOTA: O buffer deve ser preparado fresco e mantido no gelo, protegido da luz. Use dentro de 30 minutos após a preparação. Para otimização detalhada das condições de imagem STORM, consulte protocolos estabelecidos usando amostras de^{teste 15}.
   6. Adicione 200 μL de buffer de imagem STORM recém-preparado para cobrir totalmente a amostra.
2. Configuração do sistema 3D-STORM
   1. Certifique-se de que o caminho de imagem seja direcionado para uma câmera CCD de multiplicação de elétrons (EMCCD).
   2. Acione o módulo cilíndrico da lente para imagens 3D.
   3. Defina o software para o modo de aquisição 3D STORM.
   4. Configure filtros ópticos de caminho para os corantes usados.
   5. Ligue o laser de 647 nm e ajuste a potência para um nível baixo (1-5 mW).
   6. Usando um objetivo de imersão em óleo de 100× (NA ≥1,4), localize a região de interesse em widefield ou em modo de pré-visualização ao vivo do TIRF.
   7. Adquira uma imagem convencional de fluorescência de campo amplo para comparação posterior.
   8. Alterne para o modo de iluminação TIRF.
   9. Calibre o ângulo do TIRF para obter um campo de iluminação fino (~100-200 nm) para minimizar a fluorescência de fundo.
   10. Ajuste o tempo de exposição da câmera (10-30 ms) com base na intensidade inicial do sinal.
   11. Ajuste a potência do laser de imagem com base na intensidade inicial do sinal.
   12. Realize um breve teste de aquisição.
   13. Verifique se os parâmetros estão corretamente definidos sem causar fotobranqueamento rápido.
       NOTA: Garanta o alinhamento preciso do eixo cilíndrico da lente com o plano da amostra. A maioria dos sistemas modernos possui calibração automatizada. Para calibração manual, utilize esferas fluorescentes de 100 nm para verificar funções de espalhamento simétricas e de ponto redondo (PSFs).
   14. Comece com uma exposição de 10–30 ms a uma potência de laser de 647 nm de 1–2 kW/^cm2.
   15. Verifique se a densidade piscante é 0,1–1 molécula/^{μm 2}.
   16. Se a densidade for muito baixa ou muito alta, ajuste a potência do laser ou o tempo de exposição de acordo.
   17. Repita a verificação e o ajuste até que a densidade ideal seja alcançada.
3. Aquisição de dados 3D-STORM
   1. Configure o software de aquisição no modo "Ativação Contínua".
   2. Ajuste o laser de imagem (647 nm) para alta potência (entrada de fibra de 100-500 mW) para fazer a transição da maioria dos fluoróforos para o estado escuro.
   3. Ajuste o laser de ativação (405 nm) para baixa potência (0,1–5 mW).
   4. Otimize empiricamente a potência de 405 nm para manter 100–200 moléculas localizadas por quadro em uma região de 256×256 pixels.
   5. Defina o número total de quadros entre 10.000 e 20.000.
   6. Use 1 quadro de luz de ativação (405 nm) seguido por 5 quadros de luz de imagem (647 nm) por ciclo.
   7. Comece a aquisição.
   8. Operar o EMCCD com máxima sensibilidade (ganho EM aplicado)
   9. Use 10–30 ms de exposição por quadro.
   10. Durante a aquisição, monitore a densidade da molécula ativa.
   11. Ajuste a potência do laser de 405 nm para manter um fluxo constante de eventos de molécula única.
       NOTA: Dados brutos de filmes podem ser armazenados em um disco rígido padrão para arquivamento de longo prazo antes da reconstrução.
4. Análise de dados da mineralização de colágeno (usando software de análise de imagem com módulo STORM)
   1. No software de análise, selecione o driver de câmera apropriado (módulo STORM).
   2. Clique em [Interface de Análise] no painel STORM. A janela de análise se abre.
   3. Clique em [Abrir Arquivo]. Selecione o arquivo bruto da imagem da microscopia a ser analisado. Clique em abrir.
   4. Determine o valor mínimo de fluorescência (Altura Mínima) para sinais válidos.
   5. Encontre o ponto mais escuro ainda reconhecível como um sinal de molécula única.
   6. Mova o mouse para o centro.
   7. Leia o valor da altura do pico.
   8. Registre esse valor.
   9. Clique em [Configurações de Identificação]. No diálogo, defina os seguintes parâmetros: Altura Mínima (insira o valor registrado no passo 6.4.8), Altura Máxima (20000), Linha de Base CCD (100) e, para dados 3D-STORM, marque "3D" (desmarque para 2D).
   10. Clique >> para expandir mais parâmetros. Definido: Largura mínima (nm) até 200, largura máxima (nm) até 700 (400 para 2D), largura inicial de ajuste (nm) até 300, razão axial máxima até 2,5 (1,3 para 2D) e deslocamento máximo (pix) até 1.
   11. Clique em OK para fechar o diálogo.
   12. Realize uma análise de teste para validar os parâmetros. Desmarque a correção de desvio.
   13. Defina os períodos para 1.
   14. Clique em [Testar].
   15. Após a análise, clique em OK no menu pop-up.
   16. Verifique se os pontos de sinal estão corretamente identificados. O ruído de fundo não deve ser selecionado errado. Lugares verdadeiros não devem ser perdidos.
   17. Se não satisfatório, repita os passos 6.4.9–6.4.16 para ajustar os parâmetros até que estejam corretos.
   18. Após a aprovação da análise de teste, realize a análise completa. Verifique a correção de desvio.
       NOTA: O software de análise realiza correção de deriva usando um algoritmo redundante de correlação cruzada (RCC) que maximiza a correlação entre segmentos de tempo das localizações moleculares. Não são exigidas contas^{fiduciais 23}.
   19. Manter Períodos = 1.
   20. Clique em [Iniciar] (ou clique em [Testar] novamente, depois em [Começar]).
   21. Espere a análise ser concluída. Clique em OK no menu pop-up.
   22. Após a análise, dois arquivos de resultado (.bin e .txt) são gerados na mesma pasta do arquivo .nd2.
   23. Para análise de colocalização (canais de 647 nm e 488 nm), exiba ambos os canais simultaneamente na lista de canais da janela de análise.
   24. Selecione uma região de interesse (ROI) apropriada.
   25. Use o módulo de colocalização para calcular o coeficiente de correlação de Pearson. Se não for fornecido automaticamente, exporte manualmente os dados da nuvem de pontos para um plugin de colocalização em um software de análise de imagem disponível publicamente. Registre o valor.
   26. Realize análise Z-slice para confirmar a mineralização intrafibrilar. No menu principal, selecione Ver > passo Z > Slice.
   27. Extraia planos individuais em intervalos de 60 nm.
   28. Observe o sinal mineral (verde, canal de 488 nm). Verifique se o sinal persiste nas fatias centrais (Z = 0 nm ±120 nm). A persistência confirma a mineralização intrafibrilar.
   29. Opcional: realizar filtragem de densidade para reduzir a contagem excessiva de emissores densamente compactados. Abra a imagem reconstruída STORM em um software de análise de imagem disponível publicamente usando um plugin para análise de localização de molécula^{única 24}.
   30. Para reduzir a contagem excessiva de emissores densamente compactados, aplique filtragem de densidade (por exemplo, filtro mediano ou limiar local de densidade) com base na densidade do sinal.
   31. Se a correção de deriva não estiver ativada no passo 6.4.18 ou for necessária correção adicional, execute a correção de deriva. Correto com base no PSF dos marcadores fiduciais. Alternativamente, use algoritmos de correlação cruzada (por exemplo, correção de desvio implementada no mesmo plugin).
   32. Realize a desmistura espectral para eliminar a diafonia do canal. Na janela de análise STORM, clique na ferramenta de remoção de diafonia (geralmente no canto inferior direito).
   33. Defina o raio para 25,0 nm (recomendado). Selecione o canal de origem. Selecione o método de remoção: Recomenda-se estatística.
   34. Para remover a ativação cruzada causada pelo laser de excitação, selecione Subtrair além de NSA > Ativação cruzada. Clique em OK. Um novo canal, Ativação Não Específica-Xt, é gerado automaticamente.
   35. Valide os níveis de autofluorescência e sinais de fundo usando amostras controle não coradas. Certifique-se de que todos os sinais estejam rotulados especificamente.
   36. Realize visualização 3D. Selecione uma região de interesse (ROI) na janela de análise.
   37. Clique no botão [3D] (ou [Mostrar 3D]). Gerar uma projeção 3D ou renderização por volume.
   38. Clique com o botão direito para ajustar os parâmetros de renderização. Exporte vídeos em formatos comuns (por exemplo, .avi ou .mp4).
   39. Para classificar um sinal mineral como intrafibrilar, realize a análise Z-slice conforme 6.4.26–6.4.28. Perfis de intensidade de exportação.
   40. Defina o centro da fibrila como o plano Z, onde o sinal do colágeno é máximo.
   41. Um sinal mineral é considerado intrafibrilar se sua intensidade em Z = 0 (centro) e em Z = ±60 nm for ≥50% da intensidade máxima mineral nessa fibrila. Se o sinal cair abaixo de 30% em Z = 0, classifica-se como extrafibrilar.
   42. Registre a classificação para pelo menos 50 fibrilas por condição para calcular a porcentagem de mineralização intrafibrilar.
       NOTA: Plugins alternativos disponíveis publicamente também estão disponíveis para filtragem de densidade, correção de deriva e desmistura espectral.

Results

A implementação bem-sucedida desse protocolo gera uma visualização tridimensional de alta resolução das fibrilas de colágeno mineralizadas usando o 3D-STORM multicolorido. Os resultados a seguir ilustram resultados típicos, controles de qualidade e avaliações quantitativas.

A Figura 1 mostra uma reconstrução multicolorida 3D-STORM de uma rede de colágeno mineralizada com fosfato de cálcio amorfo (ACP). O colágeno (marcado com um c...

Discussion

Este protocolo oferece um fluxo de trabalho abrangente para visualização em nanoescala da mineralização de colágeno usando o 3D-STORM multicolorido. Vários passos críticos exigem atenção especial para garantir resultados bem-sucedidos.

Primeiro, a preparação da amostra é fundamental para a imagem STORM de alta qualidade. A aminosilização das placas de fundo de vidro deve ser cuidadosa para garantir a fixação estável das fibrilas de colágeno durante as etapas s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido poliaspártico (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Estabilizador para fosfato de cálcio amorfo
Cloreto de cálcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Fonte de cálcio
Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Fonte de fosfato
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Ajustador de força iônica
Ácido poliacrílico (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Estabilizador para cálcio em alta concentração
Base de tris	Sigma-Aldrich	T1503	Componente de buffer
Azida de sódio (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Agente antimicrobiano
(3-Aminopropil)trietoxissilano (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Agente de funcionalização de superfície de vidro
Etanol absoluto	Sigma-Aldrich	459836	Solvente
Solução de colágeno tipo I (50 μg/mL em ácido acético 0,1 M)	Corning	354249	Estrutura de automontagem
Condroitina sulfato (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Mimético de proteína não colagênica
EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)	Sigma-Aldrich	E7750	Agente de entrelaçamento
NHS (N-hidroxisuccinimida)	Sigma-Aldrich	130672	Ativador de entrelaçamento
Ácido livre MES	Sigma-Aldrich	M5287	Buffer para entrelaçamento
Soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)	Gibco	10010023	Buffer de lavagem e diluição
Álbumina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Agente de bloqueio
Anticorpo anti-colágeno-I de coelho	Abcam	ab34710	Anticorpo primário para colágeno
Anticorpo anti-condroitina sulfato de camundongo	Sigma-Aldrich	C8035	Anticorpo primário para CS
IgG anti-coelho de cabra conjugado a corante fluorescente de extremidade vermelha (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Anticorpo secundário para colágeno
IgM anti-camundongo de cabra conjugado a corante fluorescente vermelho (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Anticorpo secundário para CS
Calceína (corante indicador de cálcio)	Sigma-Aldrich	C0875	Marcador de fosfato de cálcio
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Detergente para o buffer de lavagem
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Componente do buffer de imagem
Oxidase de glicose (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Capturador de oxigênio
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345	Capturador de oxigênio
Cisteamina (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Tiol para piscar fluoróforo
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Substrato para oxidase de glicose
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S2889	Buffer para estoque de GOx
Ácido clorídrico (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Ajuste de pH
Hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Ajuste de pH
Ácido fosfotungstico	Sigma-Aldrich	P4006	Corante negativo para TEM
Pratos de cultura com fundo de vidro (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Substrato da amostra; espessura de 0,17 mm
Limpador ultrassônico (40 kHz)	Branson	B200	Dispositivo de limpeza
Câmara de umidade	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Para automontagem de colágeno
Microscópio eletrônico de transmissão	Hitachi	HT7800	Imagem TEM
Grelhas TEM revestidas com formvar/carbono (200 mesh)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Suporte de amostra TEM
Plataforma de agitação horizontal	Labnet	S2030-RC	Lavagem suave
Microscópio confocal de varredura a laser	Nikon	A1	Triagem preliminar
Sistema de microscópio 3D-STORM (com lasers 405/488/647 nm, lente cilíndrica, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Imagem de super-resolução
Objetiva de imersão em óleo 100× (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Imagem de alta resolução
pHmetro	Mettler Toledo	FiveGo F2	Controle de pH
Software de aquisição e análise STORM	Nikon	NIS-Elements (módulo STORM)	Aquisição e processamento de dados STORM
Formato de arquivo.nd2 (arquivo de imagem microscópica bruta)	Nikon	N/A	Formato de arquivo de imagem bruta gerado por microscópios Nikon.
Software de análise de imagem disponível publicamente	Origem aberta	N/A	Por exemplo, ImageJ com plugin ThunderSTORM para análise de localização de molécula única (colocalização, correção de deriva)
Parafilm	Bemis	PM996	Cobrindo a amostra durante a incubação
Folha de alumínio	Qualquer fornecedor de laboratório	N/A	Para proteção contra a luz (por exemplo, embrulhar amostras)
Tubos de microcentrífuga âmbar	Fisher Scientific	05-669-21	Para proteção contra a luz dos fluoróforos
Lâminas de cobertura (No. 1.5)	Corning	2855-18	Montagem da amostra