Многоцветный протокол визуализации высокого разрешения 3D-STORM для минерализации коллагена в самособранных рекомбинантных коллагеновых фибриллах типа I

Summary

Здесь мы представляем протокол для различия внутрифибриллярной и экстрафибриллярной минерализации в рекомбинантных коллагеновых фибриллах с использованием многоцветного 3D-STORM, интегрируя оптимизированное маркирование, визуализацию и количественный колокализационный анализ.

Abstract

Этот протокол описывает многоцветный трёхмерный стохастический оптический микроскопический метод реконструкции (3D-STORM) для наномасштабной визуализации минерализации коллагена в самособранной фибрилной модели коллагена типа I. Метод позволяет одновременно визуализировать коллаген, неколлагеновые белки (например, хондроитин сульфат) и минеральные фазы фосфата кальция. Подготовка образца включает аминосиланизацию и самосборку коллагена, затем минерализацию с использованием кальциефосфатной среды, которая на ранней стадии (30 минут) образует аморфный кальциевой фосфат (ACP) и созревает в гидроксиапатит (HAP) к 6 часам. Затем проводится мультиплексированная иммунофлуоресцентная маркировка, образцы сначала оцениваются с помощью конфокальной микроскопии, а затем получают 3D-STORM изображения с помощью буфера для изображений, поглощающего кислород. Обработка и анализ данных осуществляются с использованием общедоступного программного обеспечения. По сравнению с традиционной электронной или конфокальной микроскопией, этот протокол сочетает молекулярную специфичность с наноуровневым разрешением (типичная боковая точность 20–30 нм, аксиальная 50–60 нм), что позволяет трёхмерно визуализировать внутрифибриллярные и экстрафибриллярные минерализационные паттерны. Репрезентативные результаты показывают чёткую визуализацию коллагеновых сетей, связанных неколлагеновых белков и минеральных фаз в трёхмерном пространстве. Количественные метрики, включая коэффициент корреляции Пирсона (0,89 ± 0,04) и коэффициент перекрытия Мандерса (0,91 ± 0,03), приведены в разделе «Результаты». Этот протокол является мощным инструментом для исследователей в области биоматериаловедения, биоминерализации и инженерии костной ткани, которым требуется наномасштабное понимание динамики минерализации.

Introduction

Минерализация коллагена — это фундаментальный биологический процесс, играющий ключевую роль в формировании твёрдых тканей, таких как кости и^{зубы 1}. Сложная структура коллагеновых волокон в сочетании с тонкой регуляцией минерального отложения придаёт этим тканям выдающуюся механическую прочность и структурную^{целостность 2}. Коллаген служит не просто пассивным каркасом, а активным участником, организуя точное отложение минералов через сложные молекулярные и физические^{взаимодействия 3}. Разъяснение этих механизмов крайне важно для понимания патологических состояний, таких как остеопороз и кариес, а также для разработки биомиметических материалов для регенеративной терапии⁴.

Диаметр коллагеновых волокон в твёрдых тканях варьируется примерно от 50 до 100 нм, при этом частицы гидроксиапатита (HAP) ещё меньше (обычно толщина 2–5 нм и длина 20–30 нм) и вставлены в фибриллярные^{промежутки 5}. Хотя зоны зазоров могут выступать в роли нуклеационных зон, в родных тканях минералы изначально образуются в межфибриллярных пространствах, а затем расширяются в внутрифибриллярные компартменты. Традиционные методы характеристики включают гистологическое окрашивание, конфокальную лазерную сканирующую^{микроскопию 6,7} и электронную^{микроскопию 8,9}. Гистологическое окрашивание обеспечивает макроскопическую оценку, но не может оценивать состояния наноминерализации. Конфокальная микроскопия позволяет наблюдать определённые компоненты, но ограничена дифракцией (~200 нм латерально), не способна различать внутрифибриллярную и экстрафибриллярную^{минерализацию 10}. Электронная микроскопия обладает высоким разрешением, но не обладает молекулярной специфичностью. Хотя маркировка иммунозолота может обеспечить молекулярную специфичность для электронной микроскопии, она требует специализированной обработки и менее подвержена мультиплексированной трёхмерной визуализации множества компонентов по сравнению с STORM, а также включает длительные экспериментальные циклы и высокие^{затраты 11}.

Стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) преодолевает дифракционный предел, локализуя отдельные флуорофоры с высокой точностью, достигая бокового разрешения ~20 нм¹². В сравнении с другими сверхразрешающими методами, такими как микроскопия с стимулированным эмиссией (STED⁾¹³и микроскопия структурированного освещения (SIM⁾¹⁴, STORM обеспечивает более высокую точность локализации (~20 нм по бокам и ~50 нм по оси) и совместима с более широким спектром органических флуорофоров. В частности, STED требует специализированных красителей и высокой мощности лазера, способных повредить биологические образцы, тогда как SIM обеспечивает разрешение только ~100 нм, что недостаточно для разрешения фибрильных (50–100 нм) особенностей. STORM обеспечивает практический баланс между разрешением, возможностью мультиплексирования и совместимостью с образцами. Опубликованные рекомендации описывают стандартизированные тестовые образцы для оптимизации параметров изображения STORM и оценки разрешения¹⁵. В сочетании с трёхмерными возможностями съёмки 3D-STORM позволяет одновременно визуализировать наномасштаб нескольких^{компонентов 16}. Недавние достижения расширили STORM на многоцветное и мультиплексированное изображение, позволяя визуализировать несколько целей в одной^{выборке 17,18}.

Этот протокол использует биомиметическую модель in vitro, основанную на самособранных рекомбинантных коллагеновых фибриллах типа I, и специально разработан для in vitro рекомбинантных коллагеновых моделей типа I, чтобы отличать внутрифибриллярную минерализацию от экстрафибриллярной на наноуровне. Он не подходит для живых клеток, так как STORM требует фиксированных образцов и буферов для поглощания кислорода. Он также не подходит для нативных высокоминерализированных тканей (например, зрелой кости) без предварительной декальцификации или забора антигена. Если только оценка общей плотности минералов или морфологии большой площади, то традиционная конфокальная или электронная микроскопия будет более эффективной.

Общая цель этого протокола — обеспечить стандартизированный, поэтапный рабочий процесс для использования многоцветного 3D-STORM для визуализации наномасштабного распределения минералов и неколлагеновых белков внутри отдельных коллагеновых фибрилл, с особым акцентом на различение внутрифибриллярной и экстрафибриллярной минерализации. Этот протокол интегрирует оптимизированную иммуномаркировку с индивидуальным буфером визуализации, позволяя одновременно отслеживать несколько органических компонентов (коллаген, неколлагеновые белки) и неорганические фазы (ACP, HAP) в трёх^{измерениях 19}. Ключевым новшеством является количественная оценка внутрифибриллярных и экстрафибриллярных моделей минерализации. Количественная оценка достигается по двум независимым критериям: (1) расчёт коэффициента колокализации Пирсона между каналами минерала (кальциевый индикаторный краситель (например, кальцеин)) и коллагена (далеко-красный флуоресцентный краситель) с помощью модуля колокализации в программном обеспечении для анализа изображений (коэффициент >0,8 указывает на сильную ассоциацию); (2) Анализ сохраняемости минерального сигнала во всех Z-срезах отдельных фибрилл: если минеральный сигнал присутствует в центральных срезах (Z = 0–±120 нм от вертикального центра фибриллы) с интенсивностью ≥50% от максимальной, он классифицируется как внутрифибриллярный. В отличие от традиционной электронной или конфокальной микроскопии, этот протокол сочетает молекулярную специфичность с наноуровневым разрешением, обеспечивая трёхмерное пространственное распределение внутрифибриллярной минерализации.

Этот протокол разработан для исследователей в области биоматериаловедения, биоминерализации и инженерии костной ткани, требующих наномасштабного понимания динамики минерализации. Стандартизированная процедура также может быть адаптирована для изучения других минерализованных коллагеновых систем, таких как деминерализованные дентиновые срезы или гидрогели на основе коллагена, соответственно корректируя начальные этапы подготовки образцов.

Protocol

Все эксперименты с биологическими образцами проводились в соответствии с руководящими принципами и нормативами Основных учреждений Медицинской школы Чжэцзянского университета и были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (Сертификат одобрения No BSL20235710079). Описанный здесь экспериментальный протокол использует коммерческие реагенты и биомиметические системы in vitro. В ней не участвуют люди, животные или образцы человеческих тканей, поэтому не требуется этическое одобрение институционального контрольного совета.

ВНИМАНИЕ: Все процедуры, связанные с опасными химикатами, должны проводиться в вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки, защитные очки). Утилизировать химические отходы в соответствии с институциональными нормативами. Для NaN₃ собирайте отходы в специальный контейнер с маркировкой «азидные отходы» и не смешивайте с кислотами (риск взрывного газа). Для глутаральдегида инактивируйте с 10% избытком бисульфита натрия перед утилизацией. Для β-меркаптоэтанола окисьте отбеливателем (1:10 В/В) в течение 1 часа перед сливом.

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентная маркировка ДОЛЖНА проводиться ДО минерализации, чтобы избежать маскировки эпитопов минеральными отложениями. Для применений, требующих пост-минерализационной маркировки, может потребоваться извлечение антигенов.

1. Подготовка минерализационной среды

1. Подготовка минерализационной среды для восстановленных коллагеновых фибрилл
   1. Приготовьте кальциевый бульонный раствор, добавив 100 мкл 5 мг/мл полиаспартиновой кислоты (p-Asp, Mw 9-11 кДа) по капле до 5 мл раствора CaCl₂ 3,44 мл в конической трубке объёмом 15 мл.
   2. Вихрь смешивать в трубке 30 секунд, пока не станет однородным.
   3. Добавляйте p-Asp медленно и тщательно перемешивайте, чтобы стабилизировать аморфный кальцийфосфат (ACP).
   4. Добавьте 5 мл раствора фосфатов (19 мМ Na₂HPO₄ + 300 мМ NaCl) в кальциевый стандартный раствор.
   5. Вихревой микс на 1 минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Итоговые концентрации после смешивания: 1,67 мМ CaCl₂, 9,5 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl и 50 мкг/мл p-Asp.
   6. Подготовьте минерализационную среду непосредственно перед использованием. Не храните; немедленно используйте нестабильный прекурсор ACP для достижения стабильных результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение приводит к преждевременной кристаллизации.
2. Подготовка минерализационной среды для коллагеновых гелей/деминерализованного дентина
   1. Приготовьте раствор, содержащий кальций, растворив 8,77 г NaCl, 0,01 г NaN₃, 6,06 г Tris и 1,11 г CaCl₂ в 800 мл деионизированной воде.
   2. Увеличите объём до 1 л с помощью деионизированной воды.
   3. Добавьте 350 мкг/мл полиакриловой кислоты (PAA, Mw ~1800) в раствор, содержащий кальций.
   4. Вихрь на 1 минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PAA вместо p-Asp для лучшей стабилизации при более высоких концентрациях кальция.
   5. Приготовьте фосфатный раствор, растворив 0,85 г Na₂HPO₄ в 1 л деионизированной воде для получения 6 мМ Na₂HPO₄.
   6. Фильтруйте-стерилизуйте фосфатный раствор с помощью мембраны диаметром 0,22 мкм.
   7. Комбинировать равные объёмы (например, по 500 мл каждый) растворов кальция и фосфатов с магнитным перемешиванием при 300 об/мин.
   8. Регулируйте pH до 7,4 с помощью 1 M HCl или NaOH при мониторинге с помощью pH-метра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте pH на уровне 7,4 ± 0,1. Не допускайте отклонений pH >0,2, которые вызывают преждевременную кристаллизацию.

2. Подготовка рекомбинантных коллагеновых волокон

1. Аминосиланизация чашек с стеклянным дном
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой обработке используется (3-аминопропил) триэтоксисилан (APTES) для внесения положительно заряженных аминогрупп (-NH₂) на поверхность стекла, что способствует электростатической адсорбции и стабилизации отрицательно заряженных мономеров коллагена.
   1. Добавьте 200 мкл раствора APTES (5% в абсолютном этаноле) в каждую чашу с стеклянным дном (35 мм, толщина #1,5H, 0,17 мм ± 0,005 мм).
   2. Обеспечить полное покрытие поверхности тарелки с помощью раствора APTES.
   3. Инкубировать в темноте 2 часа при комнатной температуре (20–25 °C).
   4. Полосните посуду три раза абсолютным этанолом (2 мл за одну стирку).
   5. Ультразвуковое действие в деионизированной воде в течение 10 минут при частоте 40 кГц. Полностью удалите остаточный APTES, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
   6. Силанизированные блюда можно хранить сухой при 4 °C до 1 недели.
   7. (По желанию) Запекайте для большей стабильности: поместите вымытую и высушенную посуду в духовку при 100–120 °C на 30–60 минут.
   8. Дайте остыть до комнатной температуры перед началом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании пластиковой посуды уменьшайте температуру ниже 80 °C, чтобы предотвратить деформацию. Адаптируйте процедуру силанизации из Биттера и^{Мьюира 20}.
2. Самосборка и сшивание коллагена
   1. Пипетка — 100 мкл раствора коллагена I (50 мкг/мл в уксусной кислоте 0,1 м) на каждую силанизированную чашу.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 10 часов в камере с влажностью (> 90% относительной влажности). Поддерживайте стабильную влажность, чтобы предотвратить испарение раствора.
   3. Проверьте образование фибрилл с помощью фазово-контрастной или конфокальной микроскопии; Успешная подготовка показывает тонкую, паутиновую фибрильную сеть.
   4. Для проверки правильного образования фибрилл на ультраструктурном уровне подготовьте отдельный образец на поливиниловой формальной/углеродом покрытой TEM-сетке с тем же условиями самосборки (коллаген-I 50 мкг/мл, 37 °C, 10 ч, влажность > 90%).
   5. Покрасьте 1% фосфотунгстической кислотой (pH 7.0) в течение 10 минут.
   6. Мойте деионизированной водой.
   7. Осмотрите под трансмиссионным электронным микроскопом. Успешный фибриллогенез обозначен характерным D-периодическим полосатым рисунком 67 нм (см. рисунок 3).
   8. Аккуратно впитывайте остаточный раствор коллагена из чашок с стеклянным дном.
   9. Добавьте 2 мл раствора хондроитин сульфата (CS) (50 мг/мл в PBS, pH 5,5) в каждую тарелку.
   10. Инкубировать при 4 °C в течение 12 часов, чтобы обеспечить электростатическую адсорбцию CS на коллагенных фибриллах.
   11. Приготовьте раствор для сшивания EDC/^{NHS 21}: растворите 0,2 млн EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид) и 0,05 млн NHS (N-гидроксисукцинимид) в буфере MES (0,1 млн МЭС, pH 5,5).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер MES можно подготовить, растворив свободную кислоту MES в деионизированной воде и регулировав pH до 5,5 с NaOH.
   12. Удалите CS-решение и добавьте 2 мл решения для перекрёстного сшивания EDC/NHS.
   13. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы ковалентно обездвижить CS на коллагене.
   14. Помойте посуду три раза с PBS (по 5 мл каждая, по 5 минут), чтобы удалить нереагированные реагенты.
   15. Храните обработанные коллагеновые волокна в PBS при 4 °C до 24 часов до минерализации.

3. Иммунофлуоресцентная маркировка (выполняется ДО минерализации)

1. Подготовка образца
   1. Промывайте коллагеновые фибриллы три раза раствором NaCl на 500 мл (10 мл за стирку, по 5 минут каждая).
   2. Промывайте три раза деионизированной водой (по 10 мл на одну стирку, по 5 минут каждая).
   3. Выполняйте промывки на горизонтальной шейкерной платформе, вращающейся со скоростью 50 об/мин, чтобы обеспечить тщательную промывку и минимизировать сдвиговые силы, которые могут отсоединить собранные волокна.
2. Блокировка и инкубация первичных антител
   1. Инкубировать с блокирующим буфером (5% бычий альбумин в PBS) при 37 °C в течение 1 часа в увлажнённой камере.
   2. Приготовьте коктейль с антителами в блокирующем буфере: антиколлаген-I (разбавление 1:100) и мышиный анти-хондроитин сульфат (разбавление 1:100).
   3. Добавьте 200 мкл коктейля с антителами на образец.
   4. Покройте образцы лабораторной герметизирующей пленкой.
   5. Инкубировать при 4 °C ночью (12–16 часов).
   6. Защищайте от света с помощью алюминиевой фольги. После инкубации первичных антител образцы могут храниться в PBS при 4 °C до 24 часов.
3. Вторичное окрашивание антител
   1. Удалите несвязанные первичные антитела, помыв посуду три раза буфером для стирки (0,1% Tween-20 в PBS), по 10 минут за каждую стирку.
   2. Приготовьте смесь флуоресцентных вторичных антител в блокирующем буфере (200 мкл на чашу 35 мм), содержащей: козий антикроличий IgG, конъюгированный с красным флуоресцентным красителем (1:100) и козий антимышиный IgM, конъюгированный с красным флуоресцентным красителем (1:100).
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого этапа защищайте образцы от света, чтобы предотвратить фотоотбеливание фторофора.
   3. Инкубировать образцы при комнатной температуре (20–25 °C) в течение 1 часа в темноте.
   4. Помойте посуду три раза с помощью буфера (по 10 минут каждый), чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните промеченные образцы в PBS при 4 °C (защищённых светом) до 48 часов перед визуализацией. Включайте контрольные системы без первичных антител для проверки аутофлуоресценции.

4. Минерализация волокон коллагена (выполняется ПОСЛЕ маркировки)

1. Процесс минерализации
   1. Добавьте по 2 мл свежеприготовленной минерализационной среды на блюдо.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут (краткосрочно) для раннего образования минерала (ACP).
   3. Альтернативно, инкубировать при 37 °C в течение 6 часов (длительно) для кристаллизации зрелого минерала (HAP).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте точную температуру на уровне 37 °C ± 0,5 °C с помощью откалиброванного инкубатора.
   4. Аккуратно аспирируйте минерализационную среду.
   5. Прополосните три раза деионизированной водой (по 5 мл на одну стирку, с интервалом 1 минута).
2. Маркировка кальциев-фосфатом
   1. Добавьте 4 мкм кальциевого индикатора красителя (например, кальцеина) в PBS (200 мкл на чашку).
   2. Инкубировать при комнатной температуре (20–25 °C) в течение 30 минут в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кальциевый индикаторный краситель (например, кальцеин) связывается с ионами кальция и не различает аморфные и кристаллические фазы; назначение фаз основано на времени минерализации (30 мин = ACP, 6 ч = HAP). Её следует защищать от света янтарными трубками или фольгой.
   3. Промывайте пять раз: три раза деионизированной водой и два раза с 70% этанолом (по 1 минуте каждая), чередуя оба раза.
3. Подготовка образца для визуализации
   1. Погрузите образцы в буфер для визуализации: 10% (w/v) глицерина в PBS. По желанию добавьте антифейдный реагент согласно инструкции производителя.
   2. Примените достаточный объём (20–50 мкл) буфера для изображения, чтобы покрыть образец.
   3. Положите на образец накладку.
   4. Храните образцы при 4 °C в темноте до 72 часов.

5. Наблюдение под лазерным конфокальным микроскопом

1. Перенос образцов с 4 °C в комнатную температуру (20–25 °C).
2. Дайте 10 минут равновесия, чтобы предотвратить конденсацию.
3. Сохраняйте лёгкую защиту с помощью янтарных контейнеров или фольгированной плёнки.
4. Проверьте, что буфер изображения покрывает весь образец.
5. Настройте конфокальный микроскоп со следующими настройками:
   1. Для коллагеновой визуализации (красный флуоресцентный краситель): лазер 647 нм, эмиссионный фильтр 650-710 нм.
   2. Для кальциев-фосфатной визуализации (кальциевый индикаторный краситель (например, кальцеин)): лазер 488 нм, эмиссионный фильтр 500-550 нм.
   3. Цель: 100× масляное погружение (NA 1.4).
   4. Диаметр отверстия: 1 аэродинамическая единица (AU).
   5. Время пребывания пикселя: 1-2 мкс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед визуализацией выполните лазерное выравнивание и калибровку отверстия.
6. Проведите последовательное сканирование: первое сканирование с возбуждением 647 нм (коллаген).
7. Проведите второе сканирование с возбуждением 488 нм (минерал).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте каналы последовательно, чтобы избежать протока.
8. Для 3D-реконструкции установите размер шага Z-стека на 0,5 мкм или меньше для обеспечения достаточного отбора проб.
9. Сохраняйте файлы с сохранением метаданных.
10. Для анализа колокализации используйте программное обеспечение для анализа изображений, способное вычислять коэффициент корреляции Пирсона (например, общедоступное программное обеспечение с подходящими плагинами).

6. Визуализация с помощью трёхмерной стохастической оптической реконструкционной микроскопии (3D-STORM)

1. Подготовка буфера для визуализации^{STORM 22}
   ПРИМЕЧАНИЕ: В буфер визуализации добавляются оксидаза глюкозы и каталаза для извлечения кислорода, тем самым уменьшая фотоотбеливание и продлевая мигание флюорофоров, что необходимо для локализации по одной молекуле в STORM.
   1. Приготовьте стандартный раствор глюкозооксидазы (GOx) при 8 мг/мл в буфере ацетата натрия с концентрацией 50 мм (pH 5,1).
   2. Приготовьте раствор набора каталазы при 160 мкг/мл за 1× PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы фермента в аликвотах, быстро заморозьте их с помощью жидкого азота или ванны с сухим льдом/этанолом, и храните при -20 °C или -80 °C. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания.
   3. Подготовьте свежий буфер для STORM на льду, защищённый от света.
   4. Комбинируйте следующие компоненты в указанном порядке в итоговом объёме 1 мл: стерильный безнуклеазный H₂O (до 1 мл), 1 М NaCl (10 мкЛ, 10 мМ финал), 1 М трис-HCl pH 8,0 (50 мкл, 50 мМ финал), свежеприготовленный 1 М цистимарин (МЭА), скорректированный до pH ~7,0 (50 мкл, 50 мМ финал), 50% (w/v) глюкозы (200 мкл, 10% с финалом), запас GOx (200 мкл, 1,6 мг/мл финал), каталазный запас (200 мкл, 32 мкг/мл финал).
   5. Аккуратно перемешивайте с помощью пипета или инверсии. Не вихрьте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер должен быть приготовлен свежим и храниться на льду, защищённом от света. Используйте в течение 30 минут после подготовки. Для подробной оптимизации условий визуализации STORM обратитесь к установленным протоколам с использованием тестовых^{образцов 15}.
   6. Добавьте 200 мкл свежеприготовленного буфера для STORM, чтобы полностью покрыть образец.
2. Конфигурация системы 3D-STORM
   1. Убедитесь, что путь изображения направлен на электронно-умножающую CCD-камеру (EMCCD).
   2. Включите цилиндрический объективный модуль для 3D-съёмки.
   3. Установите программное обеспечение в режим 3D STORM.
   4. Настройте оптические фильтры для используемых красителей.
   5. Включите лазер на 647 нм и установите мощность на низкий уровень (1-5 мВт).
   6. Используя объектив погружения маслом 100× (NA ≥1.4), определите интересующую область в режиме широкопольного или TIRF live preview.
   7. Получите традиционное широкоугольное флуоресцентное изображение для последующего сравнения.
   8. Переключитесь в режим подсветки TIRF.
   9. Откалибруйте угол TIRF для получения узкого поля освещения (~100-200 нм) для минимизации фоновой флуоресценции.
   10. Регулируйте время экспозиции камеры (10-30 мс) в зависимости от начальной интенсивности сигнала.
   11. Регулируйте мощность лазера визуализации исходя из начальной интенсивности сигнала.
   12. Проведите кратковременное тестовое приобретение.
   13. Проверьте, правильно ли настроены параметры без быстрого фотоотбеливания.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ось цилиндрической линзы точно выравнивается с плоскостью образца. Большинство современных систем имеют автоматическую калибровку. Для ручной калибровки используйте 100-нм флуоресцентные шарики для проверки симметричных функций распределения круглых точек (PSF).
   14. Начинайте с экспозиции 10–30 мс при мощности лазера 647 нм мощностью 1–2 кВт/^см².
   15. Убедитесь, что плотность мигания равна 0,1–1 молекуле на^{мкм 2}.
   16. Если плотность слишком мала или слишком высока, регулируйте мощность лазера или время экспозиции соответственно.
   17. Повторяйте проверку и корректировку до достижения идеальной плотности.
3. Сбор данных 3D-STORM
   1. Установите программное обеспечение для получения в режим «Непрерывная активация».
   2. Установите лазер визуализации (647 нм) на высокую мощность (100-500 мВт оптоволокно) для перехода большинства флуорофоров в тёмное состояние.
   3. Установите лазер активации (405 нм) на низкую мощность (0,1–5 мВт).
   4. Эмпирически оптимизировать мощность 405 нм для поддержания 100–200 локализованных молекул на кадр в области 256×256 пикселей.
   5. Установите общее количество кадров на 10 000–20 000.
   6. Используйте 1 кадр активационного света (405 нм), затем 5 кадров изображения (647 нм) за цикл.
   7. Начинайте приобретение.
   8. Работайте с EMCCD с максимальной чувствительностью (приложенное усиление EM)
   9. Используйте экспозицию 10–30 мс на кадр.
   10. Во время сбора контролировать плотность активных молекул.
   11. Отрегулировать мощность лазера 405 нм для поддержания стабильного потока одномолекулярных событий.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Сырые данные фильма можно хранить на стандартном жёстком диске для долгосрочного архивирования перед восстановлением.
4. Анализ данных о минерализации коллагена (с использованием программного обеспечения для анализа изображений с модулем STORM)
   1. В программном обеспечении для анализа выберите соответствующий драйвер камеры (модуль STORM).
   2. Нажмите [Analysis GUI] в панели STORM. Открывается окно анализа.
   3. Нажмите [Открыть файл]. Выберите исходный микроскопический файл для анализа. Нажмите «Открыть».
   4. Определите минимальное значение флуоресценции (минимальную высоту) для допустимых сигналов.
   5. Найдите самое тёмное пятно, которое всё ещё можно распознать как сигнал из одной молекулы.
   6. Переместите мышь в центр.
   7. Прочитайте значение Peak Height.
   8. Запишите это значение.
   9. Нажмите [Настройки идентификации]. В диалоге установите следующие параметры: Минимальная высота (введите значение, записанное в шаге 6.4.8), Максимальная высота (20000), Базовая линия CCD (100), а для 3D-STORM проверка данных «3D» (снимите галочку для 2D).
   10. Нажмите >> , чтобы расширить больше параметров. Установка: Минимальная ширина (нм) до 200, Максимальная ширина (нм) до 700 (400 для 2D), Начальная ширина посадки (нм) до 300, Максимальное осевое отношение до 2,5 (1,3 для 2D) и Максимальное перемещение (pix) к 1.
   11. Нажмите OK, чтобы закрыть диалог.
   12. Проведите тестовый анализ для проверки параметров. Снимите галочку «Коррекция дрейфа».
   13. Установить периоды на 1.
   14. Нажмите [Тест].
   15. После анализа нажмите OK в диалоговом окне.
   16. Проверьте, правильно ли идентифицированы сигнальные пятна. Фоновый шум не должен быть выбран неправильно. Настоящие места нельзя пропускать.
   17. Если неудовлетворительно, повторяйте шаги 6.4.9–6.4.16, чтобы скорректировать параметры до правильного результата.
   18. После прохождения тестового анализа проведите полный анализ. Проверьте коррекцию дрейфа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа выполняет коррекцию дрейфа с использованием резервного алгоритма перекрёстной корреляции (RCC), который максимизирует корреляцию между временными сегментами молекулярных локализаций. Фидуциальные^{бусины не требуются 23}.
   19. Сохранять периоды = 1.
   20. Нажмите [Start] (или снова нажмите [Test], затем [Start]).
   21. Дождитесь завершения анализа. Нажмите OK в диалоговом окне.
   22. После анализа два файла результатов (.bin и .txt) генерируются в той же папке, что и файл .nd2.
   23. Для анализа колокализации (каналы 647 нм и 488 нм) отображайте оба канала одновременно в списке каналов окна анализа.
   24. Выберите подходящий регион интереса (ROI).
   25. Используйте модуль колокализации для вычисления коэффициента корреляции Пирсона. Если это не предоставляется автоматически, вручную экспортируйте данные облака точек в плагин колокализации в общедоступном программном обеспечении для анализа изображений. Запишите значение.
   26. Проведите анализ Z-срезов для подтверждения внутрифибриллярной минерализации. В главном меню выберите View > Z-step > Slice.
   27. Извлекать отдельные плоскости с интервалом 60 нм.
   28. Наблюдайте минеральный сигнал (зелёный, канал 488 нм). Проверьте, сохраняется ли сигнал в центральных срезах (Z = 0 нм ±120 нм). Персистенция подтверждает внутрифибриллярную минерализацию.
   29. Опционально: выполнить фильтрацию плотности для снижения пересчета от плотно упакованных эмиттеров. Откройте восстановленное изображение STORM в общедоступном программном обеспечении для анализа изображений с помощью плагина для анализа локализации по одной^{молекуле 24}.
   30. Чтобы уменьшить пересчет от плотно упакованных эмиттеров, применяйте фильтрацию по плотности (например, медианный фильтр или порог локальной плотности) на основе плотности сигнала.
   31. Если коррекция дрейфа не была включена на шаге 6.4.18 или требуется дополнительная коррекция, выполните коррекцию дрейфа. Верно, исходя из PSF фидуциальных маркеров. В качестве альтернативы используйте алгоритмы перекрёстной корреляции (например, коррекция дрейфа, реализованная в том же плагине).
   32. Выполните спектральное размикшение для устранения перекрёстных помех каналов. В окне анализа STORM нажмите на инструмент удаления перекрёстных помещений (обычно в правом нижнем углу).
   33. Установить радиус на 25,0 нм (рекомендую). Выберите исходный канал. Выберите метод удаления: рекомендуется статистический метод.
   34. Чтобы устранить перекрёстную активацию, вызванную возбуждающим лазером, выберите Вычитать в дополнение к NSA > Кросс-активация. Нажмите ОК. Новый канал, Nonspecific Activation-Xt, генерируется автоматически.
   35. Проверьте уровни автофлуоресценции и фоновые сигналы с помощью неокрашенных контрольных образцов. Убедитесь, что все сигналы имеют конкретную маркировку.
   36. Выполните 3D-визуализацию. Выберите область интереса (ROI) в окне анализа.
   37. Нажмите кнопку [3D] (или [Показать 3D]). Сгенерируйте 3D-проекцию или рендеринг объёма.
   38. Кликните правой кнопкой мыши, чтобы настроить параметры рендеринга. Экспортировать видео в обычных форматах (например, .avi или .mp4).
   39. Чтобы классифицировать минеральный сигнал как интрафибриллярный, проводите Z-срезовый анализ, как в 6.4.26–6.4.28. Профили интенсивности экспорта.
   40. Определим центр фибриллы как Z-плоскость, где сигнал коллагена максимальн.
   41. Минеральный сигнал считается внутрифибриллярным, если его интенсивность в Z = 0 (центр) и при Z = ±60 нм равна ≥50% от максимальной интенсивности минерала в этой фибрилле. Если сигнал опускается ниже 30% при Z = 0, классифицируется как экстрафибриллярный.
   42. Запишите классификацию не менее 50 фибрилл на каждое состояние, чтобы рассчитать процент внутрифибриллярной минерализации.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные публично доступные плагины также доступны для фильтрации плотности, коррекции дрейфа и спектрального разведения.

Results

Успешная реализация этого протокола обеспечивает высокоразрешающую трёхмерную визуализацию минерализованных коллагенных фибрилл с использованием многоцветных 3D-STORM. Следующие результаты иллюстрируют типичные результаты, контроль качества и количественные оценки.

На рисунке 1 показана многоцветная 3D-STORM-реконструкция коллагеновой сети, минерализированной аморфным кальциевым фосфатом (ACP). Коллаген (маркированный красным флуо...

Discussion

Этот протокол обеспечивает комплексный рабочий процесс для наномасштабной визуализации минерализации коллагена с помощью многоцветного 3D-STORM. Несколько критически важных шагов требуют особого внимания для обеспечения успешных результатов.

Во-первых, подготовка образцов является основой для высококачественной STORM-съёмки. Аминосиланизация чашек с стеклянным дном должна быть тщательной, чтобы обеспечить стабильное прикрепление волокон коллагена на протяжении...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Кислота полиаспартиновая (р-Асп)	Sigma-Aldrich	P9903	Стабилизатор для аморфного фосфата кальция
Хлорид кальция (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Источник кальция
Дифосфат натрия (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Источник фосфата
Хлорид натрия (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Регулятор ионической силы
Полиакриловая кислота (ПАК)	Sigma-Aldrich	323667	Стабилизатор для высокой концентрации кальция
Трис-база	Sigma-Aldrich	T1503	Компонент буфера
Азид натрия (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Антимикробное средство
(3-Аминопропил)триэтоксисила (АПТЭС)	Sigma-Aldrich	440140	Агент функционализации стеклянной поверхности
Абсолютный этанол	Sigma-Aldrich	459836	Растворитель
Решение коллагагена типа I (50 мкг/мл в 0,1 М уксусной кислоте)	Corning	354249	Каркас для самосборки
Хондроитинсульфат (СС)	Sigma-Aldrich	C9819	Не коллагеновый белковый миметический продукт
ЭДК (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид)	Sigma-Aldrich	E7750	Кросс-линкер
НГС (N-гидроксисукцинимид)	Sigma-Aldrich	130672	Активатор кросс-линкера
МЕС свободная кислота	Sigma-Aldrich	M5287	Буфер для кросс-линкера
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	Gibco	10010023	Буфер для промывания и разбавления
Белок сыворотки быка (БСБ)	Sigma-Aldrich	A3059	Агент блокировки
Кроличное антитело к коллагену-I	Abcam	ab34710	Первичное антитело к коллагену
Мышье антитело к хондроитинсульфату	Sigma-Aldrich	C8035	Первичное антитело к СС
Козье антитело к IgG кролика, связанное с дальне-красным флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Вторичное антитело к коллагену
Козье антитело к IgM мыши, связанное с красным флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Вторичное антитело к СС
Кальцеин (флуоресцентный кальциевый индикатор)	Sigma-Aldrich	C0875	Метка фосфата кальция
Твaн-20	Sigma-Aldrich	P1379	Детерген для буфера промывания
Глицерин	Sigma-Aldrich	G5516	Компонент буфера для исследования
Глюкозооксидаза (ГОкс)	Sigma-Aldrich	G7141	Скавенгер кислорода
Каталаза	Sigma-Aldrich	C1345	Скавенгер кислорода
ЦисTEAMин (МЕА)	Sigma-Aldrich	M6500	Тиол для мигания флуоресцентного компонента
D-глюкоза	Sigma-Aldrich	G6152	Субстрат для глюкозооксидазы
Ацетат натрия	Sigma-Aldrich	S2889	Буфер для стандартного решения ГОкс
Соляная кислота (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Корректировка pH
Гидроксид натрия (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Корректировка pH
Фосфовольфрамовая кислота	Sigma-Aldrich	P4006	Отрицательная окраска для ЭМ
Стеклянные блюдца с дном для культур (35 мм, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Субстрат для образца; толщина 0.17 мм
Ультразвуковой очищатель (40 кГц)	Branson	B200	Прибор для очистки
Чаша для увлажнения	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Для самосборки коллагагена
Электронный микроскоп	Hitachi	HT7800	Изображения ЭМ
Темнополяризованные решетки ЭМ (200 меш)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Поддержка образца для ЭМ
Горизонтальная платформа шейкера	Labnet	S2030-RC	Нежная промывка
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Nikon	A1	Предварительное исследование
Система микроскопа 3D-STORM (с лазерами 405/488/647 нм, цилиндрические линзы, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Изображения сверхразрешения
Объектив с иммерсией в масло 100× (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Изображения с высоким разрешением
pH-метр	Mettler Toledo	FiveGo F2	Контроль pH
Программное обеспечение для получения и анализа данных STORM	Nikon	NIS-Elements (модуль STORM)	Получение и обработка данных STORM
Формат файла .nd2 (файл сырого изображения микроско