Массив сравнительная геномная гибридизация (Array CGH) для обнаружения геномной количество копий Варианты

Общая цель этой процедуры заключается в сравнительной геномной гибридизации для выявления дисбалансов в геноме, которые могут привести к широкому спектру генетических заболеваний. Это достигается путем предварительного мечения ДНК пациента флуоресцентным красителем. На втором этапе пациент, ДНК и по-разному меченая референсная ДНК гибридизуются с матрицей.

Затем массив сканируется для измерения количества пациента и референсного изобилия ДН для каждого зонда. На последнем этапе отсканированное изображение обрабатывается для определения областей генома, в которых ДНК пациента содержит больше или меньше материала, чем в конечном итоге массиве референсной ДНК. Сравнительная геномная гибридизация используется для определения того, является ли пациент носителем варианта числа копий, который приводит к генетическому синдрому.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как сборка слайда массива может быть затруднена, а гибридизация проста в этом. Перемешайте высыпанную жидкость из камеры перед началом реакции маркировки. Разморозьте готовую к использованию 96-луночную пластину с нуклеотидами и праймерами при четырех градусах Цельсия и защищенной от света в течение примерно часа.

После оттаивания уравновесьте покрытую пластину еще на 30 минут при комнатной температуре, уравновесьте образцы ДНК в течение 15 минут при температуре 60 градусов Цельсия в это же время. Пока образцы нагреваются, используйте робота для работы с жидкостью, чтобы подать достаточное количество воды, не содержащей нуклеаз, в каждую лунку новой 96-луночной пластины. Затем, когда ДНК будет готова, перенесите один микрограмм образца из лунки на 96-луночную пластину с водой.

Теперь перенесите 20 микролитров уравновешивающих нуклеотидов и праймеров на каждую из пластин, содержащих разбавленные образцы ДНК, и запечатайте пластину полосковыми колпачками, стараясь обеспечить плотное прилегание. Затем денатурируйте ДНК при 99 градусах Цельсия в ПЦР-машине с нагретой крышкой через 10 минут и охладите праймеры на льду в течение пяти минут. Затем с помощью робота для работы с жидкостями добавьте 10 микролитров фермента экзо-ДНК-полимеразы в каждый образец.

Смешайте образцы с помощью пипетки, а затем запечатайте и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов. На следующий день завершите реакцию пятью микролитрами стоп-буфера на лунку, затем удалите неинкорпорированные нуклеотиды. Переложите содержимое каждой лунки в отдельные предварительно промаркированные двухмиллилитровые пробирки.

Загрузите образцы и спиновые колонки для очистки ДНК в робот для обработки спиновых колонок, а также соответствующие буферы. Согласно инструкциям производителя, робот для обработки спиновой колонки свяжет меченую ДНК с мембраной кремнезема с помощью 250 микролитров буфера для связывания ДНК с высоким содержанием солей на пробирку, после чего примеси будут удалены с мембран двумя промывками по 500 микролитров промывочного буфера каждая. Затем робот добавит 15 микролитров буфера раствора с низким содержанием солей в мембраны, чтобы восстановить очищенные меченые образцы ДНК в объемах примерно 12 микролитров для гибридизации образцов.

Далее разогрейте гибридизационную печь до 65 градусов Цельсия и разогрейте подложку и камеры гибридизации. Для приготовления гибридизационной смеси соедините 1,1 мкл кроватки 1D NA 4,95 мкл поставляемой производителем блокирующей смеси и 24,75 мкл гибридизационного буфера. Используйте робота для работы с жидкостями, чтобы распределить эту смесь по каждой лунке новой 96-луночной пластины, предварительно смачивая каждый наконечник для повышения точности переноса.

Далее пипетка 9,35 мкл соответствующей подписи, три меченые ДНК, далее 9,35 мкл соответствующей подписи, пять меченых ДНК. Чтобы каждая лунка запечатала пластину, четыре раза проложите образцы в течение одной минуты и дайте пластине быстро повернуться, чтобы собрать содержимое на дне каждой. Хорошо денатурируйте меченую ДНК в инкубаторе перед гибридизацией.

Сначала в течение трех минут при 95 градусах Цельсия, затем 30 минут при 37 градусах Цельсия. Затем работа на платформе с подогревом 42 градуса по Цельсию. Поместите опорный предметник в камеру гибридизации, убедившись, что прозрачная часть прокладки совмещена с оконной частью камеры гибридизации с помощью предварительно смоченных наконечников.

Теперь медленно пипеткой наберите 42 микролитра гибридизационной смеси в центр соответствующего положения массива подложки предметного стекла. Следим за тем, чтобы жидкость не касалась границы резинового кольца. Как только все позиции будут заполнены, осторожно опустите предметное стекло массива на опорное стекло и соберите камеру гибридизации.

Следя за тем, чтобы сторона массива с надписью была обращена к опорному салазку, затем полностью затяните винт камеры гибридизации и осмотрите собранную камеру гибридизации, убедившись, что утечки гибридизации нет. Перемешивайте за пределами границ резинового кольца и следите за тем, чтобы каждый пузырь воздуха был примерно четыре миллиметра в высоту. Когда камера гибридизации упрется в свой конец вертикально, поверните камеру гибридизации, чтобы проверить это.

Все пузырьки воздуха в каждой позиции движутся. Если какой-либо из пузырей застрял, резко постучайте по патроннику по скамейке. Затем поместите камеры гибридизации во вращающуюся печь при температуре 65 градусов Цельсия на 24 часа.

На следующий день погрузите камеры гибридизации в буфер номер один и используйте пару пластиковых щипцов с плоскими краями, чтобы раздвинуть предметные стекла. Затем выбросьте прокладки и поместите массив слайдов в стойку, погрузите в свежую буферную. Промойте горные стекла примерно в 700 миллилитров буфера для промывки в течение одной-пяти минут, энергично помешивая с помощью блохи и магнитной звезды.

Затем переложите массив слайдов примерно в 700 миллилитров буфера для промывки, два на 90 секунд с более энергичным перемешиванием в конце второй промывки. Аккуратно поднимите слайды массива из буфера. Они должны выйти сухими.

Затем загрузите матрицу слайдов в держатели слайдов на сканере вместе с защитными пленками для слайдов, а затем отсканируйте образцы. Согласно инструкциям производителя матрицы, каждый зонд на гибридной решетке визуализируется как смесь красных и зеленых флуорохромов. Отношения красного и зеленого флуоресцентного сигнала для каждого зонда количественно оцениваются сканером, а соответствующее программное обеспечение выделяет их как log two ratio в соответствии с их геномным положением.

Полученные в результате трассировки массива позволяют интерпретировать регионы, идентифицированные как генетически несбалансированные. Например, в этом следе от ребенка с синдромом Вильямса, синдромом повторяющейся микроделеции, опосредованным низким количеством копий повторов в проксимальной области седьмой хромосомы, геномный дисбаланс был идентифицирован программным обеспечением красной линией. Флуоресцентное логарифмическое соотношение должно быть близко к нулю, что указывает на соотношение зеленого к красному один к одному для нормальных областей генома.

Рассеянные массивные следы, наблюдаемые на этом сканировании, могут привести к неточному вызову аномальных областей или неспособности идентифицировать геномный дисбаланс и могут быть вызваны рядом факторов, включая плохое качество ДНК или присутствие лучей, уровни озона в атмосферной сфере. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как обрабатывать образцы пациентов для тестирования с помощью CGH и получать данные хорошего качества для последующего анализа и обнаружения вариаций числа копий.