Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu
March 27th, 2020
Floresan yaşam boyu görüntüleme, proteinlerin yaşam, yaşlanma ve stresli C. elegans hastalık modellerinde toplama eğilimlerini ölçer, ölçer ve ayırt eder.
Yöntem bize açıkça çözünür ve hatta birikmiş muadilleri entegre amiloid protein yapıları ayırt etmek için izin verir. Teknik in vivo çok az veya hiç toksik yan etkisi olmayan bir şekilde gerçekleştirilir. Floroforün floresan özelliklerine bağlı olduğundan, zamanla son derece sağlam ve tekrarlanabilir.
FLIM kanser tanısı alanında kullanılmaktadır. Ancak, biz gerçekten nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili protein toplama temel mekanizmaları incelemek için istihdam. Metodoloji protein toplama alanında kullanılabilir.
Hastalıkla ilişkili protein floresan sonda ile etiketlendiği sürece, zaman içinde izlenebilir ve izlenebilir. Toplamayı teşvik eden veya engelleyen bileşikler ve stratejiler başarılı bir şekilde incelenebilir. Işık mikroskobu ile görüntülenmeyi sağlayan herhangi bir biyolojik sistem, örneğin hücre kültüründe, sabitlenmiş veya geçirimli numunelerde ve gerekli herhangi bir ortamda, in vivo veya ex vivo fLIM için uygundur.
Deneysel veri almadan önce seçtiğiniz floroforun nematod içindeki özelliklerini test etmeyi ve ölçümleri almadan önce kurulumun tamamen işlevsel olduğunu test etmeyi unutmayın. Başlamak için, büyümek ve NGM plakaları üzerinde 20 santigrat derece nematodlar korumak. Yaş genç yetişkinler ve yaşlı yetişkinler olarak yaşamın sekizinci gün olarak yaşamın dördüncü gününe kadar nematodlar.
Görüntüleme gününde, görüntüleme slaytları hazırlayarak başlayın. Hacim olarak% 3 ağırlık tanınArak agarose ve çift distile su yerleştirin. Eritmek için bir mikrodalga içine aktarın ve sonra biraz soğumasını bekleyin.
Bir mililitrelik pipet ucunu kesin ve erimiş agarose yaklaşık 200 mikrolitre almak. Pipet temiz bir cam slayt üzerine agarose ve hemen herhangi bir kabarcıkoluşumunu kaçınarak üstüne ikinci bir yerleştirin. Slaytları kurumaya bırakın ve üstteki cam kaydırağı nazikçe çıkarın.
Sonuç nematodlar konumlandırılmış olacak eşit bir agarose yüzeyi ile bir cam slayt. Görüntüleme kurulumu kullanıma hazır olduğunda, stereo mikroskop altında çalışarak, 10 mikrolitrelik bir anestezik bileşiğin damlasını agarose pedin üzerine yerleştirin ve yavaşça içine 5 ila 10 nematod aktarın. Nematodları ayırmak için kirpik ucu kullanın.
Görüntü edinimi sırasında nematodların daha kolay yerelleştirilmesine olanak sağlamak için onları birbirine yakın tutun, ancak dokunmadan tutun. Dikkatle bir coverslip ile nematodlar bindirme. Montajdan sonra bir saat içinde, ölçümler alın.
Nematodların tamamen hareketsiz olduğundan emin ol. FLIM satın alma yazılımını açın. Sekme düğmesini bulun ve etkinleştirme çıktılarına basın.
Sahneye monte edilmiş C.elegans ile slayt yerleştirin ve iletim modunda 10X büyütme lens kullanarak, slayt üzerinde nematodların konumunu yerelleştirmek. Slağı çıkarın, hedefi 63X büyütme merceğiile çevirin ve gerekli daldırma ortamını uygulayın. Slaytı sahneye yerleştirin ve nematodları yerelleştirin.
Örneği taramaya başlayın. İlgi çekici bir bölge seçin ve maksimum projeksiyon düzlemine odaklanın. FLIM yazılımının arabiriminde, algılanan foton sayısını önizleyin.
ADC değeri bir kere 10 ile dördüncü arasında, 10-5 arasında olmalıdır. Gerekirse, farklı bir düzlemde odak kayması veya daha fazla foton toplamak için lazer gücünü artırmak. Eğer foton kazık önlemek ama iyi bir ömür boyu uyum ve ölçüm oluşturmak için fotonyeterli miktarda toplamak emin olun.
Menü çubuğunda, edinme parametrelerini ayarlamak için sekmeyi seçin. Tek bir foton algılamasına izin vermek için scan eşitle'yi seçin. Edinmeyi sabit bir zaman miktarına veya sabit sayıda fotona ayarlayın.
Basın satın almaya başlamak için başlar. Yazılımı açın ve Dosya üzerinden FLIM veri dosyalarını aktarın, FLIM verilerini yükleyin. Farklı seanslarda ve farklı biyolojik tekrarlardan elde edilebilse bile tüm numuneleri tek bir koşuldan yükleyin.
Gerekirse, segmentasyon, segmentasyon yöneticisi ile birçok FLIM resim için sinyal nematod segment. Kırpma aracını vurgulanana kadar ilgi alanının etrafına sürükleyin. Tamamlandıktan sonra Tamam'a basın. C.elegans'ın yoğunluk tabanlı görüntüsünün göründüğü küçük bir bölge seçin.
Bu bölgenin bozunma eğrisi arabirimin sağ tarafındaki büyük bozunma penceresinde görünür. Veri sekmesinde, kullanım ömrünü tahmin etmek için, iyi bir uyum sağlamak için çok loş pikselleri hariç tutmak için 40 ila 300 arasında rasgele tümleşik bir minimum değer ayarlayın. FLIM sinyalini bu değerlerle sınırlamak için en az bir zaman ve en uzun süre numarası seçin.
Önceden ayarlanmış sayımları değiştirmeyin foton. Satın alma sırasında kullanılan lazer megahertz tekrarlama oranı giriş. Tüm doymuş pikselleri hariç tutmak için bir kapı maksimum değeri girişi.
Ömür boyu sekmesinde, kullanılacak genel bir montaj seçin. Seçilen floresan bozunma çok üstel olduğu ve tek bir yaşam süresinden daha fazla sergilediği biliniyorsa, üstel seçim sayısı dışında başka bir parametredeğiştirmeyin. IRF menüsünden IRF'yi yükleyin.
IRF kaymasını tahmin etmek için IRF'yi seçin, IRF değişimini tahmin edin. IRF sekmesinde otomatik olarak bir değer kümesi görüntülenir. Bu kurulduktan sonra, bu sekmenin diğer parametrelerini değiştirmeyin.
Tüm parametreler ayarlandıktan sonra uygun veri kümesine basın. Mavi çizgide vurgulanan ortaya çıkan sığması tüm olaylarla çakışmalıdır. Tüm olaylar uyum boyunca hizalandığında iyi bir uyum elde edilir.
Yazılımın arabiriminin sağ üst menülerinde bulunan parametreler sekmesini tıklatın ve istatistik, ağırlıklı ortalamaseçin ve ki kare değerinin mümkün olduğunca yakın olup olmadığını kontrol edin. Böylece seçilen görüntünün yaşam boyu değeri tau bir olarak ortaya edilir. Dosya, ihracat yoğunluğu görüntüleri, uygun sonuç tablosu, görüntüler, histogramlar aracılığıyla ilgi herhangi bir bilgi dışa aktarın.
C.elegans'ın yaşamın dördüncü veya sekizinci gününde kaslı Q40 RFP'yi ifade eden temsili haritaları burada gösterilmiştir. IQ85'in uzun Q uzantısı agregasyona daha yatkındı ve yaşamın dördüncü gününde histogramda floresan ömür boyu değişim sergiledi. Aslında, dördüncü günde IQ44'te yokken IQ85 için foci oluşumu gözlendi.
Yaşlanma üzerine, Ancak, IQ44 de fosi oluşumu ve böylece azaltılmış floresan ömrü sergiledi. Son olarak, nq40CFP suşunda fosi oluşumu saptanmadı ve floresan ömrü azaltıldı. Bu gerginlik için, yaşlanma üzerine ortalama floresan ömür boyu sadece ince olmayan önemli değişiklikler vardı.
Nematod modeli kurulduktan sonra, toplanan foton miktarı iyi bir ömür boyu uyum elde etmek için çok önemlidir. Yöntem, forster rezonans enerji transferi, FRET, fotobeyazrlama sonrası floresan geri kazanımı, FRAP veya ölçüm gibi farklı tekniklerle daha da birleştirilmiş olabilir. Tüm bu adaptasyonlar protein çalışmalarının özellikleri ve birleştirilmiş formu hakkında ekstra bilgi sağlar.
Protein toplama ve protein homeostazı alanında, sistemde uygulanan herhangi bir tedirginliğin, farklı protein türlerinin dağılımının, insan ticaretinin ve genel olarak canlı organizmadaki çözünmez ve çözünmez protein fraksiyonlarının farkını ve önemini araştırmasına olanak sağladı. Anestezik sodyum azit toksiktir ve eldiven ve gözlük ile ele alınmalıdır ve bir duman başlık altında seyreltilmiş. Teknik mikroskopi tabanlı olduğundan lazerlerle ilgili tüm uyarıları takip etmek önemlidir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, yaşayan C. elegans modellerinde protein agregasyonunu izlemek ve nicellemek için floresan ömür görüntülemesini (FLIM) kullanır. Teknik, nörodejeneratif hastalıklarla ilgili protein yapılarının invaziv olmayan gözlemlenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Protein agregasyonu, nörodejeneratif hastalıklarda önemli bir özelliktir.
- FLIM, farklı protein durumlarını ayırt etmek için bir yöntem sunar.
- Teknik, minimal toksisite ile in vivo gerçekleştirilir.
- FLIM'in nörobilimin ötesinde, kanser teşhisi gibi uygulamaları vardır.
Çalışmanın Amacı
- Protein agregasyonunun mekanizmalarını araştırmak.
- Entagre amiloid yapıları ve çözünür proteinler arasında ayrım yapmak.
- FLIM'i yaşlanma ve stres bağlamında C. elegans modellerine uygulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Floresan ömür görüntülemesı (FLIM)
- C. elegans'ın in vivo görüntülemesı
- İnvaziv olmayan gözlem teknikleri
- Protein agregasyonu dinamiklerinin analizi
Ana Sonuçlar
- Amiloid protein yapılarının çözünür karşılıklarından başarılı bir şekilde ayrımı.
- Zaman içinde FLIM'in sağlamlık ve tekrarlanabilirliğinin gösterilmesi.
- Protein agregasyonunun nörodejeneratif hastalıklarla ilişkisinin vurgulanması.
- Görüntüleme tekniğinin minimal toksik yan etkilerinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- FLIM, yaşayan organizmalarda protein agregasyonunu incelemek için değerli bir araçtır.
- Yöntem, nörodejeneratif hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, kanser araştırması da dahil olmak üzere diğer alanlara uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Fluorescence lifetime imaging (FLIM) enables noninvasive, quantitative monitoring of amyloid fibrilization in living models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs. By distinguishing integrated amyloid structures from soluble species without staining, FLIM provides predictive confidence in early discovery workflows. The method’s robustness and reproducibility facilitate cross-functional collaboration and scalable assay development for protein homeostasis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing amyloid fibrils from soluble and accumulated protein species in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, fluorescence-lifetime-based readouts that correlate directly with aggregation levels.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by allowing comparison of fibrilization across genetic backgrounds, environmental stimuli, or amyloid variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling label-free, longitudinal tracking of protein aggregation in specific cells such as neurons.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through FLIM’s independence from fluorophore expression levels and resistance to photobleaching.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by detecting aggregation-promoting or -preventing strategies in any light-microscopy-compatible biological system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by monitoring aggregation dynamics across aging and proteostasis network perturbations in disease-relevant models.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by quantifying soluble versus insoluble protein fractions in living organisms over time.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when studying protein homeostasis, enabling comparison of trafficking and distribution of protein species without further staining.
Pipeline & Workflow Integration
FLIM integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing quantitative, noninvasive readouts of protein aggregation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of amyloid structures in specific cells such as neurons during aging.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through photon collection and lifetime fitting that exclude dim pixels and saturated signals for robust measurements.
- Analytics: Provides statistical outputs such as chi-square values near one and weighted mean lifetime (tau one) to compare conditions and assess fit quality.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling observation of aggregation in aging models and upon proteostasis network perturbation, relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for comparing fibrilization across different amyloid proteins, genetic backgrounds, or environmental stimuli in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein aggregation studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of amyloid detection in vivo without staining or bleaching.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of aggregation propensity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, longitudinal aggregation data in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence lifetime imaging and laser safety protocols.
- Needs FLIM-capable microscopy setup with appropriate objectives (e.g., 63X immersion) and photon detection capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters such as scan sync, repetition rate, gate max, and photon collection thresholds (10⁴–10⁵ ADC).
- Involves adaptation considerations across model systems, including agarose pad preparation, anesthetic use (e.g., sodium azide), and immobilization protocols.
- Includes practical limitations such as the need to pre-test fluorophore properties in the nematode model and avoid photon pileup during acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:25
Synchronization of C. elegans and Mounting Nematodes onto Microscopy Slides
2:58
Acquisition of FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) Data
4:32
Analysis of FLIM Data Using FLIMfit Software
7:15
Results: Fluorescence Lifetimes
8:15
Conclusion
