Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi
June 18th, 2020
Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.
Tekstilde mevcut protokol değerlendiriciler, hücre içi kompartmana özgü bir şekilde redoks durumu değişir. Protokolümüz oksidatif stresin tüm fizyolojik veya patofizyolojik mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını ve izlenmesini sağlar. Bu teknik, sinyal ifade düzeyleri, fotoğraf ağartma ve algılama hassasiyetleri arasındaki farkları dengelemek için bir oran metrik çıktı kullanarak bozulmamış hücrelerde kiremit göz sülfür oranının kesintisiz nicelik sağlar.
Bu protokol bitkilerdeki bakteriler de dahil olmak üzere çeşitli organizmalara uygulanabilir. Deneyin ilk gününde iki dakika boyunca bir kabarık meme kanseri hücre hattından hücreleri tedavi, edta% 5, 0.2 iki mililitre ile. Hücreler parçalanmaya başladığında reaksiyonu altı mililitre tam orta ile tutuklar ve hücreleri santrifüj le tortular.
Taze, tam orta beş mililitre pelet askıya Re, hücreleri saymak ve 1.5 kez 10 tam orta bir mililitre başına beşinci hücrelere seyreltmek. Sonra tohum 1.5 kez 10 iyi bir 6 kuyu plaka başına hücrelerin mililitre başına beşinci hücrelere, ve hücre kültürü kuluçka hücre hücreleri bir gecede kuluçka. Veya hiçbir viral satır GFP transdüksiyon ekleyin.
Ertesi sabah, 12.5, 25 ve 50 mikrolitre bir ila 100 seyreltilmiş altı kez 10 mililitre başına 10 plak şekillendirme birimleri eklemek hiçbir viral aşındırılmış GFP çözeltisi eklemek, tam ortamda ekleyin. Uygun kuyular veya 6 kuyu plaka sırasıyla 50, 100 ve 200 enfeksiyon çarpAr hücreleri ile aktamak için ekleyin. Tüm örnek Wells virüs ile transe kten sonra, 16 ila 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için hücreleri iade edin.
Ertesi gün, floresan mikroskobu ile hücreleri görselleştirmek ve orta ile supernatant yerine, virüs olmadan hücrelerin ek bir 24 saat kurtarmak için izin vermek. Optimal transdüksiyon verimliliğini belirlemek için, akış sitometrisi ile hücrelerin floresan yoğunluğunu ve morfolojisini değerlendirin. Biyogüvenlik seviyesi iki sertifikalı biyolojik güvenlik kabini içinde aerosoller veya sıçramalardan enfeksiyona neden olabilecek tüm prosedürleri uyguladığınızdan emin olun.
Hücrelerin redoks durumunu değerlendirmek için, ertesi sabah, hücreleri ve 10 mikromolar hidrojen peroksit ile 6 kuyu plaka uygun Wells kuluçka, edta başına 0.2% 5 damla 750 mikrolitre ile hücreleri ayırmadan önce, iyi gösterdi. Kuyu başına tam orta iki mililitre ile reaksiyonu durdurun ve ayrı 15 mililitre konik tüpler her durum için supernatants çekin. Hücreleri santrifüj ile çökün ve peletleri 500 mikrolitre PBS'de iki kez santrifüjlerle yıkayın.
İkinci yıkamadan sonra, hücre süspansiyonlarını 40 mikro metre kafesten, ışıktan korunan buz üzerinde akış sitometriuyumlu tüplere filtreleyin. Akış sitometre yazılımında, enfeksiyon kontrol örneğinin sıfır çokluğunu çalıştırın. Sonra hidrojen peroksit ve tedavi edilmemiş hücreleri analiz edin.
Bu belirtilen formülü kullanarak, satır GFP azaltılmış formları arasında ortalama floresan yoğunluk oranı nın hesaplanmasına olanak sağlayacaktır. Burada akış sitometri tarafından hücrelerin çok sayıda seçmek için gating stratejisi gösterilir. Akış sitometrisi, sıra GFP analizi için doz yanıt eğrisini ve enfeksiyon girişinin en verimli çokluğunu belirlemek için de kullanılabilir.
Enfeksiyonun çokluğuna göre, bu temsili analizde doz yanıt eğrisi, enfeksiyonun 200 çokluk en yüksek yol GFP ekspresyonu verdi, ancak hücre morfolojisi sitotoksisite düşündüren etkili oldu. Bu nedenle optimum transdüksiyon verimi 100 enfeksiyon çokluğu olarak belirlenmiştir. Bu redoks durum analizinde, araç için akış sitometri analizi ve dört adet 10 mikromolar pozitif kontrol hidrojen peroksit tedavisi ile okside ve azaltılmış sıra GFP ortalama floresan yoğunlukları elde edilmiştir.
Overlaid histogramlar 10 mikromolar hidrojen peroksit ve araç tedavi grupları veya azaltılmış ve oksitlenmiş erode GFP hücre numarasındaki kaymaları temsil eder. Bu analiz için oksitlenmiş ve azaltılmış sıra GFP arasındaki oranın hesaplanmasında 10 mikromolar hidrojen peroksitin araç tedavisine göre sıra GFP'nin oksidasyonunda üç kat artışa neden olduğu ortaya konmıştır. Doğru hücre numaralarına sahip olmak MRI hesaplamaları ve tekrarlanabilirlik için önemlidir.
Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, araştırmacılar iyice homojen süspansiyonlar elde etmek için antiviral çözeltileri karıştırmak gerekir. Bu protokol, araştırmacıların hızlı redoks değişimlerini normal hücresel süreçlerin ve hastalığın gerçek zamanlı ilerlemesinin ayrılmaz bir parçası olarak incelemelerine olanak tanır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, hücreler içinde subsellüler bölme özgü redoks durumunu değerlendirmek için redoks duyarlı bir floresan prob kullanan bir yöntemi tanımlar. Bu teknik, sağlam hücrelerde redoks durumunun bozulmamış niceliğini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Redoks Biyolojisi
- Oksidatif Stres
Arka Plan
- Redoks durumlarını anlamak, oksidatif stresi incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Redoks duyarlı probler, hücresel mekanizmalar hakkında bilgiler sağlar.
- Redoks durumundaki değişiklikler fizyolojik veya patofizyolojik koşulları gösterebilir.
- Bu yöntem çeşitli organizmalara uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Hücrelerde oksidatif stresi izlemeyi sağlamak.
- Redoks durumlarını ölçmek için bozulmamış bir yöntem sağlamak.
- Oksidatif koşullara hücresel tepkileri anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Redoks duyarlı bir floresan probun kullanımı.
- Sinyal farklılıklarını dengelemek için oransal analiz.
- Protokolün çeşitli hücre tiplerine, kanser hücreleri de dahil olmak üzere uygulanması.
- Numune hazırlığı için hücre işleme ve santrifüjlemesi.
Ana Sonuçlar
- Sağlam hücrelerde redoks durumlarının başarılı bir şekilde nicellenmesi.
- Farklı hücre tipleri arasında uygulanabilirliğin gösterilmesi.
- Oksidatif stresin fizyolojik mekanizmaları hakkında bilgiler sağlanması.
- Redoks değişikliklerinin gerçek zamanlı izlenmesinin sağlanması.
Sonuçlar
- Bu protokol hücrelerde redoks durumunu değerlendirmek için etkilidir.
- Oksidatif stres mekanizmalarını incelemek için değerli bir araç sunar.
- Yöntem çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Assessing subcellular redox dynamics enables mechanistic de-risking in target validation by linking oxidative stress pathways to disease phenotypes. This method supports predictive confidence in preclinical models through quantitative, ratiometric readouts of cellular oxidation states. It provides translational continuity from discovery to lead identification by monitoring redox changes in living systems without disrupting cellular physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying redox shifts in response to oxidative stressors like H2O2.
- Operational Value: Enables functional target validation via subcellular compartment-specific resolution of roGFP signal.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing dose-response relationships between oxidant exposure and GFP oxidation ratios.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline redox states in MDA-MB-231 cells.
- Operational Value: Delivers assay standardization through ratiometric measurement that corrects for expression variability and photobleaching.
- Scalability: Supports platform reuse across cell types and organisms as demonstrated in breast cancer and bacterial models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Connects redox measurements to disease-relevant systems using triple-negative breast cancer as a pathophysiological model.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring real-time redox changes during disease progression.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking by linking oxidative stress mechanisms to functional cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing redox status as a quantifiable biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring oxidation/reduction ratios in live cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through flow cytometry-compatible sample preparation and gating strategies.
- Analytics: Delivers quantitative readouts via mean fluorescent intensity ratios of oxidized versus reduced roGFP forms.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling real-time monitoring of redox changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for oxidative stress assessment across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oxidative stress mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of redox measurements across experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative redox response thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, flow cytometry, and adenoviral transduction techniques.
- Needs instrumentation for dual-excitation fluorescence detection (405 nm and 488 nm) and emission at 525 nm.
- Demands cross-team standardization of transduction protocols, H2O2 treatment timing, and ratio calculation methods.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targeting of roGFP constructs beyond cytosolic expression.
- Includes practical limitations such as cytotoxicity at high multiplicity of infection, requiring optimization for each cell type.
