Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos
December 11th, 2015
Os astrócitos no SNC mudam suas propriedades funcionais e estruturais em resposta a estímulos nocivos. Este relato apresenta um protocolo para avaliação da morfologia tridimensional de astrócitos em condições de doença ou após intervenções terapêuticas.
O objetivo geral deste procedimento é avaliar a morfologia dos astrócitos analisando imagens tridimensionais de astrócitos que foram adquiridas por microscopia confocal. Este método pode ser usado para avaliar alterações morfológicas que podem aparecer em vários tipos de células, seja em condições patológicas ou como efeito de uma estratégia de intervenção. A principal vantagem desta técnica é que muitos parâmetros associados à arquitetura celular podem ser estudados simultaneamente.
A Dra. Mariam Bodel demonstrará este procedimento Após a preparação das lâminas para coloração imuno-histoquímica, desparize as seções submergindo-as em xileno duas vezes por 10 minutos. Incube as lâminas por 10 minutos em cada um dos 99,8%95% e 70% de etanol para reidratar as seções após a lavagem. A PBS incuba as lâminas em uma diluição de um a 1500 de proteína ácida fibrilar glial ou solução de anticorpo primário GFAP a quatro graus Celsius durante a noite.
Após a incubação, lavar as secções em PB S3 vezes durante cinco minutos. Em seguida, incubar as lâminas com uma solução de anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina de um a 100 durante uma hora à temperatura ambiente. Novamente, lave a seção em PB S3 vezes por cinco minutos, menos de 30 minutos antes do uso.
Adicione uma gota de solução de cromogênio vermelho a três mililitros de tampão de substrato. Incube cada lâmina em 100 microlitros desta solução por 15 a 20 minutos no escuro. Em seguida, lave as lâminas em PB S3 vezes por cinco minutos.
Finalmente, corar os núcleos com DPI diluído um a 500 em PBS. Aplique uma a duas gotas de meio Antifa na seção e sele imediatamente com uma lamínula. Incube as lâminas a quatro graus Celsius por 24 a 48 horas antes da microscopia para garantir a vedação.
Para iniciar a microscopia confocal, coloque uma lâmina no microscópio stage e selecione a objetiva de 63 x. Depois de abrir o software de aquisição, clique em configuração inteligente na guia de aquisição e selecione o andar de quatro adequado. Aqui, dappy e Alexa, andar 5 55 são usados.
Em seguida, clique em melhor sinal, seguido de aplicar. Em seguida, clique em definir exposição para permitir que o computador determine os parâmetros de exposição ideais Para otimizar a imagem, abra a janela de canais e mude a imagem para ao vivo. Ajuste o foco, se necessário.
Em seguida, clique em um au para otimizar o orifício, ajuste o ganho para obter a melhor intensidade. Por fim, defina o ganho digital entre dois e três. Após essa otimização, pare a imagem ao vivo e abra a janela do modo de aquisição.
Ajuste o tamanho do quadro clicando em X por Y e selecione 10 24 por 10 24. Escolha também uma velocidade lenta. Em seguida, abra a guia de média e selecione um número maior ou igual a quatro.
Em seguida, clique no botão de encaixe e salve a imagem 2D capturada. Para configurar a imagem 3D, abra a guia de configuração inteligente e marque o item da pilha ZS, o que fará com que a janela da pilha Zs seja aberta. Para definir a primeira e a última posições do Zack, novamente, clique ao vivo e ajuste o foco para a posição superior do astrócito.
Clique em definir primeiro. Agora ajuste o foco para a posição mais baixa do astrócito e clique em definir último e, em seguida, pare a visualização ao vivo. Em seguida, escolha o intervalo clicando em ótimo.
Para definir o número de fatias aqui, o intervalo é de 1,01 micrômetros. Por fim, clique em iniciar, experimente e salve as imagens assim que a verificação for concluída. Além disso, adquira uma imagem 2D usando uma objetiva de 10 x ou 20 x.
Para medições de intensidade de fluorescência, selecione a ferramenta retângulo ou círculo na janela de imagem e destaque uma área para medição para quantificar o volume e a área de superfície do corpo celular e território do soma do núcleo do astrócito. Transfira as imagens 3D para um programa de software de análise apropriado, como o Velocity 6.1 no software de análise. Crie uma nova biblioteca e arraste todas as imagens para a coluna cinza esquerda.
Selecione uma imagem 3D e ative um dos canais de interesse adquiridos, como dapi. Para medições nucleares, ajuste manualmente o brilho para otimizar o contraste. Agora selecione o menu de ferramentas.
Escolha make volume e produza uma única imagem 3D a partir das imagens Zack. Abra o menu de edição e clique em propriedades. Verifique se as propriedades X, Y e Z são exibidas.
Em seguida, escolha a ferramenta ROI à mão livre na barra de ferramentas. Usando a ferramenta selecionada, desenhe uma linha ao redor do núcleo rotulado com DPI para medir o volume e a área de superfície do núcleo do astrócitos. Novamente, usando a ferramenta ROI à mão livre, meça o volume e a área de superfície de todo o astrócito desenhando uma linha ao redor do soma seguindo a superfície de todos os ramos.
Clique no menu de medidas na parte superior da janela de imagem, arraste encontrar objetos para o topo da janela e dê um nome descritivo para preencher um, selecione a cor associada e clique em medir, que abrirá uma nova janela. Nesta nova janela. Escolha volume ou área de superfície como parâmetro e clique em OK.
Para salvar os dados, clique no menu de medição e selecione fazer item de medição. Selecione um novo item de medição chamado na janela. Insira um nome de arquivo para os dados e clique em OK.
Por fim, exporte os dados de medição para um pacote de software apropriado para realizar análises estatísticas e gerar gráficos de dados. Aqui, os pesquisadores compararam astrócitos em tecido cerebral fixo de ratos tratados com beta amilóide 40 ou com beta amilóide 40 e Ian. A injeção do tratamento com a proteína amilóide resultou em astrócitos com ramos mais grossos e longos.
Esses astrócitos de animais tratados com Ian exibiam uma forma estrelada com ramos curtos e finos. Os ratos tratados com Ian também demonstraram fluorescência positiva reduzida de astrócitos GFAP nas fatias do cérebro. A análise morfométrica dos volumes específicos dos astrócitos revelou que o volume do astrócitos, núcleo, corpo celular, astrócitos inteiros e território dos astrócitos diminuiu com o tratamento com Ian em comparação com o tratamento com amilóide sozinho.
Uma vez dominada esta imagem, a técnica de análise pode ser concluída em poucos minutos por célula, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante marcar a estrutura com alta precisão. É melhor praticar a marcação manual da estrutura de interesse antes de iniciar o experimento após seu desenvolvimento.
Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular, histologia e patologia explorarem a estrutura de uma célula em um ambiente saudável ou de doença. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir 12 parâmetros diferentes para uma única célula usando imagens 3D.
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Visão Geral
Este relatório apresenta um protocolo para avaliar a morfologia dos astrócitos em três dimensões usando microscopia confocal. O método avalia as alterações morfológicas nos astrócitos sob condições patológicas ou após intervenções terapêuticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Patologia
Contexto
- Astrócitos no SNC exibem mudanças em resposta a estímulos nocivos.
- Compreender a morfologia dos astrócitos é crucial para estudar várias condições neurológicas.
- Este protocolo permite a análise simultânea de múltiplos parâmetros de arquitetura celular.
- A microscopia confocal fornece imagens tridimensionais de alta resolução.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a morfologia dos astrócitos em condições de doença.
- Avaliar os efeitos de intervenções terapêuticas na estrutura dos astrócitos.
- Desenvolver um protocolo confiável para análise morfológica.
Métodos Utilizados
- Preparação de lâminas para coloração imuno-histoquímica.
- Deparaffinização das seções usando xilol.
- Reidratação das seções através de soluções graduadas de etanol.
- Incubação com anticorpo primário GFAP para identificação de astrócitos.
Principais Resultados
- Demonstração de mudanças morfológicas nos astrócitos.
- Identificação de alterações estruturais em resposta a intervenções.
- Validação do protocolo para estudos futuros.
Conclusões
- O protocolo efetivamente avalia a morfologia dos astrócitos.
- As descobertas contribuem para a compreensão dos papéis dos astrócitos na patologia do SNC.
- Aplicações futuras podem melhorar as estratégias terapêuticas para doenças neurológicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of astrocyte morphology enables mechanistic de-risking in neurodegenerative target validation by linking structural changes to therapeutic interventions. This 3D confocal morphometric approach supports predictive confidence in early discovery by providing multiparametric readouts that reflect pathway-specific glial responses. The method enhances translational continuity from in vitro or in vivo models to preclinical decision-making through standardized, reproducible imaging workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying astrocyte structural remodeling in response to amyloid beta and intervention strategies.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric analysis of glial reactivity, reducing mechanistic ambiguity in CNS target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and intervention-induced morphological phenotypes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative 12-parameter morphometric outputs suitable for high-content screening adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by modeling reactive astrogliosis in amyloid-exposed rat brain tissue, aligning with translational biomarker pathways in neurodegeneration.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal tracking of astrocyte structural changes across treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative glial morphology data that informs target selection and pathway de-risking.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through structural phenotyping of astrocytes in pathological and intervention contexts.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via standardized 3D imaging and multiparametric analysis.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including volume, surface area, branch length, number, fluorescence intensity, and density.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via disease-relevant astrocyte reactivity modeling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through standardized imaging and analysis protocols applicable across cell types and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, immunohistochemical staining, and 3D image analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including confocal microscope with Z-stack capability and 3D analysis software such as Volocity.
- Cross-team standardization requirements for staining protocols, imaging parameters, and morphometric measurement consistency.
- Adaptation considerations across model systems including in vivo and in vitro astrocyte preparations from various species.
- Practical limitations supported by source material including the need for precise manual structure marking and optimization of imaging settings for signal-to-noise ratio.
